劉義武，韓鵬，黃輝，*，王碧

（1.內江師范學院化學化工學院，四川內江641199；2.果類廢棄物資源化省高校重點實驗室，四川內江641199）

在飛速發(fā)展的今天，人們對功能食品的需求迅速增加。在功能食品配方中，膳食纖維具有多種功能和高度適用性，成為食品工業(yè)中的一種重要成分。膳食纖維（dietary fiber，DF）[1-3]是指聚合度（monomeric units，MU）大于2且不能夠被人體小腸內源酶水解也不能被小腸吸收的碳水化合物，包括三類：（1）天然存在于水果、蔬菜和谷物等食物中的非淀粉多糖，或食物原料經化學、物理或酶法提取或合成的非淀粉多糖（聚合度大于 9）；（2）聚合度在 3～9 的抗性低聚糖；（3）聚合度大于9的抗性淀粉；經化學、物理或酶法提取或合成的聚合物必須證明其對健康有益的科學證據(jù)才是膳食纖維。DF具有降低食物胃腸通過時間、增加糞便量、降低血總膽固醇、降低餐后血糖等功效，有利于降低肥胖、糖尿病和高血壓的發(fā)病率，被譽為人體必需的“第七大營養(yǎng)素”[2-8]。中國營養(yǎng)學會推薦的正常成年人膳食纖維攝入量為25 g/d，而統(tǒng)計表明，中國人實際攝入量僅約一半[1-2]。全球膳食纖維市場2014年為24.7億美元，預計膳食纖維市場將以復合年增長率13.4%的速度高速增長，2020年達53.2億美元[2，9]。因此，膳食纖維已經成為食品領域的研究熱點之一。

膳食纖維按水溶性分為可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）兩類，分別具有不同生理功能[2]。IDF與SDF比例直接決定DF生理功能。SDF含量超過總膳食纖維（total dietary fibre，TDF）30%（或 SDF/IDF在 0.43～1）有利于充分發(fā)揮其生理功能[9-11]。與谷物膳食纖維相比，柑橘類膳食纖維除SDF含量高外，還具有較強的抗氧化能力和抑菌等功能（由含量豐富的類黃酮等物質提供），已廣泛應用于食品保鮮與功能食品研發(fā)等領域[12-14]。檸檬膳食纖維自由基的清除能力、總抗氧化能力強[15-18]。檸檬膳食纖維的膨脹、保水和保油性能均明顯高于其它水果[19]。此外，檸檬膳食纖維中SDF含量接近30%，略微改性就可得到SDF含量超過30%的膳食纖維。酶法制備膳食纖維不但反應條件溫和，而且可以降低IDF的含量，增加SDF含量。因此，采用復合酶法制備檸檬膳食纖維，研究木瓜蛋白酶與α-淀粉酶酶濃度、液料比、制備時間、緩沖液pH值、制備溫度對膳食纖維質量的影響，并采用正交試驗優(yōu)化復合酶制備最佳工藝。通過本研究可以推動酶法制備高質量膳食纖維的深入研究，為商業(yè)化生產提供更好的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

檸檬皮渣：四川安岳檸檬加工廠。

1.1.2 試劑

木瓜蛋白酶（800 U/mg）、α-淀粉酶（40 U/mg）：食品級，上海金穗生物科技有限公司；95%乙醇、檸檬酸、檸檬酸三鈉、丙酮：分析純，成都金山化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：上海興創(chuàng)科學儀器設備有限公司；TD5-I離心機：四川署科儀器有限公司；SHB-B95循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海洪都電子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料處理

檸檬皮渣初步篩選，去除雜物和變質皮渣，放入皮重2倍～3倍的水中，加熱煮沸5 min～10 min，水浸泡洗滌至無色，50℃干燥，粉碎過60目備用。

1.2.2 復合酶制備膳食纖維

稱取5.0 g預處理后的檸檬粉，加入一定量的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液，一定量的木瓜蛋白酶以及α-淀粉酶，在一定的溫度下攪拌一定時間，加熱至95℃，滅酶5 min。制備條件：料液比為1∶10（g/mL）～1 ∶30（g/mL）；木瓜蛋白酶用量為 0.2 mg/g～1.8 mg/g；α-淀粉酶用量為 1.0 mg/g ～5.0 mg/g；pH 3～7；時間10 min～120 min；溫度 35℃～75℃。

1.2.3 制備可溶性膳食纖維

過濾：將滅酶后的樣品離心分離，熱水洗滌一次，合并上清液。醇析：上清液減壓濃縮至二分之一，用3倍體積的體積分數(shù)為95%的乙醇醇析，靜置15 min。

提純：抽濾后，用體積分數(shù)為75%的乙醇、體積分數(shù)為95%的乙醇各洗滌2次，50℃干燥。

1.2.4 制備不溶性膳食纖維

煮沸：過濾后所得濾渣中加入100 mL去離子水，加熱至沸騰并持續(xù)1 min～5 min。

過濾：趁熱抽濾并用體積分數(shù)為95%的乙醇及丙酮各洗滌2次，50℃干燥。

1.2.5 制備總膳食纖維

醇析：滅酶后的樣品減壓濃縮至二分之一，冷卻至20℃。用3倍體積的體積分數(shù)為95%乙醇醇析，靜置30 min。

提純：抽濾后，分別用體積分數(shù)為75%的乙醇、體積分數(shù)為95%的乙醇、丙酮洗滌2次，50℃干燥。

1.3 正交試驗設計

參照單因素試驗的結果，選擇pH值、制備溫度、制備時間、木瓜蛋白酶用量、α-淀粉酶用量5個試驗因素為研究對象選用L16（45）進行正交試驗見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in orthogonal design

1.4 膳食纖維的分析

1.4.1 樣品膳食纖維含量的測定

采用GB 5009.88-2014《食品安全國家標準食品中膳食纖維的測定》測定膳食纖維含量[20]。

1.4.2 殘渣中灰分的測定

依照GB 5009.4-2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》直接灰分法進行。

1.4.3 殘渣中蛋白質的測定

依照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法進行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Origin 2018軟件制圖，用正交設計助手II專業(yè)版V3.1分析試驗數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 木瓜蛋白酶的影響

控制 α-淀粉酶 2 mg/g，料液比 1∶20（g/mL），制備緩沖液pH值為6，制備溫度為45℃，制備時間30 min，木瓜蛋白酶酶量對膳食纖維得率的影響如圖1所示。

圖1 木瓜蛋白酶濃度對膳食纖維得率的影響Fig.1 Effect of papain concentration on the extracting rate of dietary fiber

由圖1可知，當酶量為0.2 mg/g～0.8 mg/g時，可溶性膳食纖維得率隨酶量的增加而持續(xù)增加，但繼續(xù)增加時，可溶性膳食纖維得率則趨于穩(wěn)定，而不溶性膳食纖維得率則持續(xù)降低。這是因為在酶量為0.2 mg/g～0.8 mg/g時，可以酶解的不溶性膳食纖維未反應完全，而酶量大于0.8 mg/g后酶解不溶性膳食纖維的反應繼續(xù)進行，部分可溶性膳食纖維酶解為溶于乙醇的小分子[21-22]，原料酶解反應趨于平衡，可溶性膳食纖維得率不再增加但不溶性膳食纖維仍在減少。所以0.8 mg/g（640 U/g）左右為較佳酶濃度。

2.1.2 α-淀粉酶的影響

α-淀粉酶酶濃度對膳食纖維得率的影響見圖2。

圖2 α-淀粉酶酶濃度對膳食纖維得率的影響Fig.2 Effect of α-amylase concentration on the extracting rate of dietary fiber

由圖2知，α-淀粉酶用量在1 mg/g～3 mg/g時可溶性膳食纖維的得率增長少，整體表現(xiàn)為先增加后減少。在α-淀粉酶酶量較少時主要由木瓜蛋白酶與原料作用反應，而α-淀粉酶酶反應較少，而后升高是因含量增加，再降低是因為過多α-淀粉酶會附著在細胞壁上影響木瓜蛋白酶的反應，使可溶性膳食纖維得率降低。不溶性膳食纖維則表現(xiàn)為持續(xù)降低后增加，降低原因來自可溶性膳食纖維的減少和淀粉的減少，升高則是因原料中有未反應完全的不溶性膳食纖維導致的，可確定α-淀粉酶在3.0 mg/g～4.0 mg/g（120 U/g～160 U/g）之間最為合適。

2.1.3 緩沖液pH值的影響

緩沖液pH值對膳食纖維得率的影響見圖3。

圖3 緩沖液pH值對膳食纖維得率的影響Fig.3 Effect of pH on the extracting rate of dietary fiber

由圖3可知，溶液pH值在低于4之前，幾乎無可溶性膳食纖維產出，表明兩種酶在pH＜4時活性均很低。pH值從4.0到6.0可看出，可溶性膳食纖維得率迅速增加，這是因為隨pH值增加酶的活性迅速增加；在6.0至7.0之間，得率則開始降低，因此，可確定雙酶在pH值為6時共同作用最佳。

2.1.4 料液比的影響

料液比對膳食纖維得率的影響見圖4。

圖4 料液比對膳食纖維得率的影響Fig.4 Effect of ratio of raw material to liquid on the extracting rate of dietary fiber

料液比的影響如圖4所示，當其比例大于1∶20（g/mL）時，SDF得率隨料液比的減小而增加。這是因為在溶液較少時，酶在檸檬皮細胞內無充分擴散的空間，使其未能反應完全，隨溶液的增加反應越加充分，因此得率增加，當料液比小于1∶30（g/mL）后，SDF得率有所下降[23]。其原因是酶用量一定，當溶液過多時，而酶解時間較短，酶液來不及擴散，部分IDF未能被酶反應，IDF收率略有增加，TDF基本穩(wěn)定。因此，可確定料液比 1∶20（g/mL）為最佳比例。

2.1.5 制備溫度的影響

制備溫度對膳食纖維得率的影響見圖5。

圖5 制備溫度對膳食纖維得率的影響Fig.5 Effect of modification temperature on the extracting rate of dietary fiber

由圖5可知，SDF在45℃～65℃之間得率較高，而低于45℃或者高于65℃時得率均較低，主要原因是木瓜蛋白酶及α-淀粉酶在45℃～65℃之間時活性較高[24-25]，溫度過低或過高都會導致酶的活性下降，從而導致得率下降，因此，制備溫度可選擇在45℃至65℃之間。

2.1.6 制備時間的影響

制備時間對膳食纖維得率的影響見圖6。

圖6 制備時間對膳食纖維得率的影響Fig.6 Effect of modification time on the extracting rate of dietary fiber

由圖6可知，隨著時間的增加，SDF得率持續(xù)增加并趨于穩(wěn)定，IDF得率則表現(xiàn)為持續(xù)降低并趨于穩(wěn)定。由圖6可以看出，反應時間在20 min即可分解大部分檸檬粉，50 min即能完全反應。因此，本法制備DF時間若時間大于50 min將無實際意義。綜合時間及得率考慮，可定30 min為最佳提取時間。

2.2 正交試驗

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experiments

因IDF得率受SDF得率的影響，因此，正交試驗以SDF得率為評價標準。極差分析可知，在復合酶提取膳食纖維中，5個單因素對提取檸檬中SDF得率影響的主次關系依次為pH值＞溫度＞木瓜蛋白酶用量＞制備時間＞α-淀粉酶用量，制備時間和α-淀粉酶用量影響小。SDF得率的最佳組合為：A3B4C4D3E4，綜合能耗、酶成本等各因素并結合對制備效果的影響程度分析可確定最佳條件為：A3B4C2D3E1即pH 6.0，制備溫度60℃，制備時間30 min，木瓜蛋白酶用量0.8 mg/g（640 U/g），α-淀粉酶用量 2.4 mg/g（96 U/g），料液比1 ∶20（g/mL）。

按上述確定的最佳工藝條件做3次平行試驗，試驗結果為SDF得率為（28.2±0.6）%，高于試驗中的所有組合，IDF 得率為（42.2±1.2）%，SDF/TDF=（39.8±1.6）%，超過 30%[9-10]。

2.3 原料及產品成分分析

取預處理后的檸檬粉、最佳工藝提取的SDF與IDF各稱取3份，按食品中膳食纖維測定的國標法（GB 5009.88-2014）中酶-重量法進行含量分析[15]，原料及產品成分分析見表3。

表3 原料及產品成分分析Table 3 Materials and products composition analysis

試驗結果如表3，檸檬皮中TDF、IDF、SDF平均質量分數(shù)為66.2%、45.0%、21.2%；最佳工藝提取的產品中，TDF粗品成分平均值分別為73.0%、43.2%、28.9%；IDF及SDF粗品各自的純度為74.0%、72.4%。酶法制備的膳食纖維SDF的含量增加超過20%，說明酶法制備提高了SDF含量，降低IDF含量。所得的DF產品純度達到了國家標準中純度的要求。并且，膳食纖維得率較高，說明酶解反應較為完全，復合酶制備膳食纖維優(yōu)勢明顯。

3 結論

本文研究利用木瓜蛋白酶及α-淀粉酶雙酶改性制備檸檬膳食纖維。通過正交試驗得出復合酶制備檸檬膳食纖維的最佳工藝：木瓜蛋白酶和α-淀粉酶按質量比1∶3混合作為復合酶，復合酶用量3.2 mg/g，pH 6.0，制備溫度60℃，制備時間 30 min，料液比 1∶20（g/mL）。試驗原料為加工副產物，不僅充分利用了資源，而且還減少了污染。用復合酶法制備膳食纖維，不僅能縮短反應所需時間，提高效率，而且還能除去蛋白質、淀粉等物質，提高其純度。因此，復合酶法水解、制備檸檬皮膳食纖維既可為檸檬皮渣新增盈利渠道，提高其附加值，又可以推動酶法制備膳食纖維的發(fā)展。