（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化152061）

黑豆[Glycine max（L.）merr.]為豆科植物大豆的干燥種子，味甘性平，歸肝、腎經(jīng)，含有黑豆色素、纖維素、果膠、維生素、多糖以及多種微量元素[1]。黑豆皮中的花青素作為一種天然來源的物質(zhì)，具改善貧血、抗癌、抑制高血糖癥、抗氧化和保護(hù)視力等功能[2-4]，安全，無毒性，主要通過人工合成和天然植物中提取獲得。

目前傳統(tǒng)提取方法有提取率較低，耗時(shí)長，溶劑使用量大等缺陷。離子液體（ionic liquid）是由無機(jī)陰離子和有機(jī)陽離子構(gòu)成的離子型化合物[5]，在黏度、沸點(diǎn)、蒸氣壓和熱穩(wěn)定性等方面有特殊的理化性質(zhì)，在中草藥提取領(lǐng)域及中藥提取領(lǐng)域逐漸應(yīng)用[6-7]。潘思源等咪唑類離子液體提取榿葉棠棣總黃酮，提取效果優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑[8]；黃飛等采用離子液體提取廢茶葉中的咖啡因，提取率達(dá)到95.1 mg/5 g，高于水提法[9]。微波法提取是利用電磁場(chǎng)的輻射能力，使體系迅速升溫從而破壞細(xì)胞，在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行有效分離的一種方法[9]，具有提取效率高、提取效果好、耗時(shí)短的特點(diǎn)。我國黑豆資源豐富，但是對(duì)黑豆皮的開發(fā)利用率較低，通過響應(yīng)曲面優(yōu)化離子液體-微波輔助黑豆皮花青素的提取工藝尚未見報(bào)道，該研究可為黑豆皮花青素在保健藥物及食品中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆：黑龍江綏化市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（98%）：南京世洲生物科技有限公司；1-己基-3-甲基咪唑溴鹽、百靈威、無水乙醇、甲醇、香草醛、鹽酸：國藥試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-100型高速萬能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；MW PRO微波萃取系統(tǒng)：上海安東帕商貿(mào)有限公司；Alpha1502型紫外可見分光光度計(jì)：上海譜元儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原花青素提取量的測(cè)定

稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別量取 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液定容于10 mL容量瓶中，根據(jù)香草醛-鹽酸法[10]，在500 nm波長處測(cè)定吸光度，以原花青素標(biāo)準(zhǔn)液的濃度及吸光度值為橫縱坐標(biāo)，得回歸方程為Y＝0.968 5X＋0.004 9，R2＝0.996 2，由回歸方程計(jì)算原花青素提取量。

1.3.2 花青素提取量的計(jì)算

稱取一定量的黑豆皮粉末，在不同的料液比、離子液體濃度、溫度、時(shí)間、功率下微波提取。取適量溶液作為樣品溶液，在500 nm波長處測(cè)定其吸光度，按照以下公式計(jì)算花青素的提取量：

式中：C為花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M為豆皮質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 提取時(shí)間

精密稱定黑豆皮粉末2.0 g，固定離子液體濃度為0.6 mol/L，料液比 1∶30（g/mL），提取溫度 50 ℃，微波功率 500 W，分別考察不同提取時(shí)間（5、6、7、8、9 min）對(duì)花青素提取量的影響。按1.3項(xiàng)下的方法測(cè)定并計(jì)算花青素的提取量。

1.3.3.2 料液比

精密稱定黑豆皮粉末2.0 g，固定離子液體濃度為0.6 mol/L，提取時(shí)間 7 min，提取溫度 50℃，微波功率500 W，分別考察不同料液比（1∶10、1∶20、1 ∶30、1∶40、1∶50 g/mL）對(duì)花青素提取量的影響。按1.3項(xiàng)下的方法測(cè)定并計(jì)算花青素的提取量。

1.3.3.3 溫度

精密稱定黑豆皮粉末2.0 g，固定離子液體濃度為0.6 mol/L，料液比 1 ∶30（g/mL），提取時(shí)間 7 min，微波功率500 W，分別考察不同提取溫度（30、40、50、60、70℃）對(duì)花青素提取量的影響。按1.3項(xiàng)下的方法測(cè)定并計(jì)算花青素的提取量。

1.3.3.4 離子液體濃度

精密稱定黑豆皮粉末2.0 g，固提取時(shí)間7 min，料液比1∶30（g/mL），提取溫度50℃，微波功率 500 W，分別考察不同離子液體濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L）對(duì)花青素提取量的影響。按1.3項(xiàng)下的方法測(cè)定并計(jì)算花青素的提取量。

1.3.3.5 微波功率

精密稱定黑豆皮粉末2.0 g，固定離子液體濃度為0.6 mol/L，提取時(shí)間 7 min，料液比 1 ∶30（g/mL），提取溫度50℃，分別考察不同微波功率（300、400、500、600、700 W）對(duì)花青素提取量的影響。按1.3項(xiàng)下的方法測(cè)定并計(jì)算花青素的提取量。

1.3.4 回歸模型的建立

通過單因素的試驗(yàn)結(jié)果，以離子液體濃度、微波功率、料液比、提取溫度4個(gè)因素為中心點(diǎn)，花青素提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定黑豆皮中花青素的最佳提取條件，方案及結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面因素和水平Table 1 The factor and level of the response surface

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)花青素提取效果的影響

提取時(shí)間對(duì)黑豆皮花青素提取效果的影響，如圖1所示。

圖1 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction efficiency

由圖1可知，花青素的提取時(shí)間在5 min～9 min時(shí)，提取量隨時(shí)間的延長呈現(xiàn)先快速增大后緩慢降低的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間超過8 min時(shí)，花青素的提取量開始下降?？赡苁翘崛r(shí)間短花青素未完全溶出，提取量較低；繼續(xù)延長提取時(shí)間，微波輻射還可能會(huì)破壞花青素的結(jié)構(gòu)，提取率下降[1]。因此，提取時(shí)間選擇8 min。

2.1.2 料液比對(duì)花青素提取效果的影響

料液比對(duì)黑豆皮中花青素提取效果的影響，如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction efficiency

由圖 2 可知，當(dāng)料液比在 1∶10（g/mL）～1∶50（g/mL）時(shí)，花青素的提取量呈現(xiàn)快速增大后緩慢降低的趨勢(shì)。當(dāng)料液比超過1∶40（g/mL）時(shí)，花青素的提取量開始下降。原因可能是提取體系中溶劑量過小，微波輻射能的傳遞和吸收無法充分發(fā)揮，而且提取溶劑少，體系很快達(dá)到飽和，不利于物料的傳遞。若料液比繼續(xù)增大，其他非花青素類物質(zhì)的溶出量也越大，可能干擾花青素的含量測(cè)定[12]。因此，提取花青素的料液比選擇 1∶40（g/mL）。

2.1.3 提取溫度對(duì)花青素提取效果的影響

提取溫度對(duì)黑豆皮中花青素提取效果影響，如圖3所示。

圖3 提取溫度對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

由圖3可知，當(dāng)提取溫度在30℃～70℃時(shí)，花青素提取量隨著溫度的升高呈現(xiàn)先快速增大后緩慢降低的趨勢(shì)。當(dāng)溫度超過60℃時(shí)，花青素的提取量開始下降。這是因?yàn)楹诙蛊ぶ谢ㄇ嗨卦跍囟容^低的條件下不易充分溶出，溫度升高加快了溶劑分子的擴(kuò)散速度，使其更容易滲透到細(xì)胞中，加速花青素的溶出。但是在過高溫度的條件下，可能會(huì)使花青素結(jié)構(gòu)上的酚羥基被氧化，花青素的結(jié)構(gòu)被破壞，提取量下降[13]。因此，提取花青素的溫度選擇60℃。

2.1.4 離子液體濃度對(duì)花青素提取效果的影響

離子液體濃度對(duì)花青素提取效果的影響，如圖4所示。

圖4 離子液體濃度對(duì)提取效果的影響Fig.4 Effect of ionic liquid concentration on extraction efficiency

由圖4可知，離子液體濃度在0.2 mol/L～0.8 mol/L時(shí)，花青素的提取量隨著濃度的增加呈現(xiàn)先快速增大后緩慢降低的趨勢(shì)。當(dāng)濃度為0.8 mol/L時(shí)，提取量達(dá)到最大，隨后開始下降。分析其原因可能與離子液體自身的黏度有關(guān)，提取體系的濃度過大會(huì)降低提取劑對(duì)藥材的滲透能力，使得黑豆皮花青素的溶出減慢，花青素的提取量下降[14]。因此，提取花青素的離子液體選擇0.8 mol/L。

2.1.5 微波功率對(duì)花青素提取效果的影響

微波功率對(duì)花青素提取效果的影響，如圖5所示。

圖5 微波功率對(duì)效果的影響Fig.5 Effect of microwave power on the extraction efficiency

由圖5可知，當(dāng)微波功率在200 W～600 W之間時(shí)，花青素提取量隨著微波功率的增大而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)微波功率達(dá)到500 W時(shí)，花青素提取量達(dá)到最大?？赡苁欠肿釉谖⒉▓?chǎng)的作用下能產(chǎn)生瞬時(shí)極化并迅速生成大量的熱能，微波能量會(huì)導(dǎo)致黑豆粉末細(xì)胞破裂，分子運(yùn)動(dòng)加快，有利于有效成分的溶解和釋放；微波輻射功率過高同時(shí)加速了植物細(xì)胞內(nèi)其他雜質(zhì)的溶出，花青素的溶解量減少[15]，導(dǎo)致提取率下降。因此，提取花青素的微波功率選擇500 W。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及方差分析

回歸分析結(jié)果見表3。

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 The regression analysis results

續(xù)表3 回歸分析結(jié)果Continue table 3 The regression analysis results

采用Design-Expert8.0.6對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所建模型的方差分析見表4。得到花青素提取量與各試驗(yàn)因素的多元二次回歸方程模型：Y=+4.80+0.035A-0.044B+0.096C-0.14D+0.024AB+0.026AC+0.040AD-0.027BC-0.051BD-0.034CD-0.60A2-0.29B2-0.13C2-0.19D2。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis table

由表3可知，P＜0.0001（極顯著）；失擬值P=0.2881＞0.05（不顯著），可以說明該回歸方程與試驗(yàn)擬合性較好，模型決定系數(shù)R2=0.997 3模型擬合程度好，回歸方程各項(xiàng)方差分析表明，各因素對(duì)黑豆皮花青素含量的影響大小為A＞C＞B＞D。此外，二次項(xiàng)對(duì)模型影響均達(dá)極顯著水平（P＜0.01），交互項(xiàng) AC、AD、BC、BD、CD 對(duì)花青素影響有顯著性（P＜0.05），其余項(xiàng)影響不顯著（P＞0.05）。通過對(duì)回歸系數(shù)檢驗(yàn)可知，各因素花青素提取量的影響順序?yàn)榱弦罕龋倦x子液體濃度＞提取溫度＞微波功率。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

圖5為試驗(yàn)各因素對(duì)黑豆皮花青素影響的響應(yīng)面曲圖。若考察的兩因素交互作用的響應(yīng)面曲面相對(duì)陡峭，說明兩兩因素間交互作用顯著；如果響應(yīng)曲面相對(duì)平滑，說明該兩因素交互作用不顯著。其中（a）、（b）、（c）、（d）響應(yīng)曲面相對(duì)較陡，表明料液比與提取溫度、料液比與離子液體濃度、料液比與微波功率、提取溫度與離子液體濃度之間的交互作用比較顯著；（e）、（f）響應(yīng)曲面相對(duì)較為平滑，說明提取溫度與微波功率、離子液體濃度與微波功率之間交互作用小，對(duì)花青素的提取量影響小。該觀察結(jié)果與模型方差分析結(jié)論一致，各因素交互作用對(duì)花青素的提取量的影響順序?yàn)?BD＞AD＞CD＞BC＞AC＞AB。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of interaction of various factors

2.2.3 優(yōu)化條件提取測(cè)定結(jié)果及驗(yàn)證

利用模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，最終得出黑豆皮花青素的最佳提取條件：提取時(shí)間45min，離子液體濃度0.68mol/L，料液比 1 ∶30.25（g/mL），微波功率 461 W，提取溫度49.40℃，理論預(yù)計(jì)值4.849 mg/g?？紤]到實(shí)際試驗(yàn)操作的情況，對(duì)最佳工藝條件進(jìn)行調(diào)整，最終選擇提取時(shí)間45 min，離子液體濃度 0.7 mol/L，料液比 1∶30（g/mL），微波功率460 W，提取溫度49℃，在此最優(yōu)條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果表明花青素提取量為4.834 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值接近，可用于預(yù)測(cè)不同提取條件下黑豆皮花青素的提取量。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化黑豆皮花青素的提取工藝，確定最佳工藝為：提取時(shí)間45 min，離子液體濃度0.7 mol/L，料液比 1 ∶30（g/mL），微波功率 460 W，提取溫度49℃，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)；在此條件下黑豆皮花青素的得率可達(dá)4.834 mg/g，與模型的預(yù)測(cè)值相近，表明該模型可靠，本試驗(yàn)得到的花青素提取量與于莉莉等[16]、和曹柏營等[17]相比分別提高了1.25倍和4.39倍，該工藝耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便、提取效率高、溶劑用量少，為今后花青素保健食品及藥物的相關(guān)的研究提供了一定依據(jù)。