高秀娥，梁雪晴，劉薇，鐘雪松，付慧鑫，曹柏營

（吉林工程技術師范學院食品工程學院，吉林長春130052）

黑豆富含蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)[1-3]，種皮中花青素含量非常豐富[4]，這種類黃酮化合物具有抗氧化、降血糖、降血脂、預防動脈粥樣硬化等多種生物活性[5-8]，是活性較高的植物源抗氧化劑。

在植物源花青素提取中，蛋白質(zhì)、糖類、單寧等雜質(zhì)的存在影響花青素產(chǎn)品的純度、穩(wěn)定性和生物活性[9-11]，采用柱層析、高速逆流色譜和高效液相色譜等方法可去除雜質(zhì)，精制花青素[12-14]，從工業(yè)化應用角度考慮，大孔樹脂柱層析法最易應用，報道的樹脂型號有 AB-8、D101、XAD-7、DM301 和 DM21 等[15-17]，樹脂孔徑、表面積和極性等對花青素精制效果影響顯著。

植物花青素表現(xiàn)出較好的降血糖活性，可抑制α-葡萄糖苷酶的活性，阻礙葡萄糖的形成，降低小鼠餐后血糖水平[18-20]。目前關于黑豆花青素降血糖活性的報道較少，本文以黑豆皮為原料，利用大孔樹脂柱層析法對黑豆花青素進行精制，并探討其對α-葡萄糖苷酶和α-胰淀粉酶活性的影響，從體外評價黑豆花青素的降血糖活性，為黑豆資源的精深加工提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑豆選擇烏皮青仁豆：購于農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場，破碎后風選收集黑豆皮，粉碎，過60目標準篩，備用。

1.1.2 試劑與儀器

722SP型可見分光光度計：上海圣科儀器設備有限公司；THZ-100B型恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學儀器有限公司；YDF50型多功能粉碎機：浙江屹立工貿(mào)設備有限公司；AL104型分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ALPHA 1-4 LD PLUS型真空冷凍干燥機：德國Marin Christ公司；ZD-2型電位滴定儀：上海匯分電子科技有限公司；RE-3000B型循環(huán)水真空泵：上海亞榮儀器責任有限公司。

α-葡萄糖苷酶（100U/mL）、α-胰淀粉酶（50U/mg）：上海金穗生物科技有限公司；4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、3，5-二硝基水楊酸、阿卡波糖：美國Sigma公司；D101、AB-8型大孔吸附樹脂：天津允開樹脂科技有限公司；XR929H、XR6702、XR901H、XR828S型大孔吸附樹脂：上海遜爾化工科技有限公司；無水乙醇、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、無水醋酸鈉（均為分析純）：沈陽化學試劑廠。

1.2 黑豆花青素的提取工藝

以60%乙醇作為提取溶劑，按1∶15（g/mL）料液比，在60℃的條件下提取黑豆花青素3 h，回流提取2次，合并濾液，減壓濃縮，冷凍干燥備用，黑豆花青素純度為28.14%。

1.3 黑豆花青素的精制

1.3.1 吸附率與解吸率的計算

黑豆花青素含量的計算方法參考曹柏營等[21]方法，吸附率和解吸率計算公式如下：

式中：C0為原液中黑豆花青素的含量，mg/mL；C1為吸附后溶液中黑豆花青素含量，mg/mL；C2為洗脫后溶液中黑豆花青素含量，mg/mL。

1.3.2 樹脂優(yōu)選

取預處理后的D101、AB-8、XR929H、XR6702、XR901H和XR828S型大孔吸附樹脂各10 g，置于三角瓶中，分別加入20 mL 0.5 mg/mL的黑豆花青素原液，室溫（25℃）振蕩3 h，過濾得濾液，測定黑豆花青素含量，計算吸附率；吸附黑豆花青素的樹脂置于三角瓶中，分別加入20 mL 60%的乙醇水溶液，室溫（25℃）振蕩3 h，過濾得濾液，測黑豆花青素的含量，計算解吸率，選擇吸附率和解吸率最好的樹脂做為黑豆花青素精制樹脂。

1.3.3 樹脂吸附和解吸平衡曲線

稱取10 g XR6702型大孔樹脂，置于三角瓶中，添加100 mL黑豆花青素溶液，室溫（25℃）振蕩，每隔30 min測定一次黑豆花青素含量，并繪制出吸附率-時間曲線；吸附結(jié)束后，過濾去除濾液，加入100 mL 60%的乙醇水溶液，室溫（25℃）振蕩，每隔30 min測定一次黑豆花青素含量，并繪制出解吸率-時間曲線。

1.3.4 黑豆花青素濃度對吸附率的影響

取質(zhì)量濃度 0.5、1.0、1.5、2、2.5、3.0、5、10 mg/mL的黑豆花青素溶液各20 mL，置于三角瓶中，加入10 g預處理的XR6702型大孔樹脂，室溫（25℃）振蕩3 h，過濾得濾液，測黑豆花青素含量，計算吸附率。

1.3.5 吸附液pH值對黑豆花青素吸附率的影響

取20 mL質(zhì)量濃度2.0 mg/mL的黑豆花青素置于不同三角瓶中，pH 值分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入10 g預處理的XR6702型大孔樹脂，室溫（25℃）振蕩3 h，過濾得濾液，測黑豆花青素含量，計算吸附率。

1.3.6 乙醇濃度對黑豆花青素解吸率的影響

三角瓶中加入30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液各50 mL，分別加入10 gXR6702型大孔樹脂（吸附飽和），室溫（25℃）振蕩3 h，過濾得濾液，測黑豆花青素含量，計算解吸率。

1.3.7 解吸液pH值對黑豆花青素解吸率的影響

三角瓶中各加入60%的乙醇50 mL，pH值調(diào)整為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，分別加入 10g XR6702型大孔樹脂（吸附飽和），室溫（25℃）振蕩3 h，過濾得濾液，測黑豆花青素含量，計算解吸率。

1.3.8 洗脫流速對解吸率的影響

XR6702型大孔樹脂經(jīng)預處理后置于層析柱中（3.5 cm×50 cm），以去離子水平衡12 h，加入2.0 mg/mL的黑豆花青素溶液15 mL，全部進入樹脂層后，洗脫劑為 60%乙醇水溶液，分別以 0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL/min的解吸流速洗脫，收集解吸液，測黑豆花青素含量，計算解吸率。

1.4 黑豆花青素的體外降血糖活性

1.4.1 黑豆花青素對α-葡萄糖糖苷酶活性的影響

按王銳[22]的測定方法，并做適當修改。各取2.0 mL質(zhì)量濃度為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/mL的精制黑豆花青素溶液，加入α-葡萄糖糖苷酶（45 U/mL）和 PNPG（15 mmol/L）各 0.5 mL，渦旋1 min，置于37℃孵育30 min，取出后立即加入NaCO3（1 mol/L）1 mL終止反應，于405 nm處測定吸光度，以2.0 mL蒸餾水代替黑豆花青素作為陰性對照組，以阿卡波糖為陽性對照組。各組重復測定3次，酶活性抑制率計算公式如下：

式中：AS為樣品吸光度值；ASO為加入滅活酶的樣品吸光度值；AC為空白組吸光度值；ACO為加入滅活酶的空白組吸光度值。

1.4.2 黑豆花青素對α-胰淀粉酶活性的影響

按曾橋等[23]的方法測定，并做適當修改。分別配制 質(zhì)量分數(shù)為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/mL的精制黑豆花青素溶液，取不同濃度黑豆花青素溶液各 0.2 mL，加入 0.2 mL α-胰淀粉酶（1 U/mL），37℃孵育10 min，與0.4 mL可溶性淀粉溶液（2.5 g/L）混合，37℃ 孵育10 min，取出后立即加入3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）顯色劑[含1%2，5-二硝基水楊酸和12%酒石酸鉀鈉的NaOH（0.4 mol/L）溶液]1 mL終止反應，沸水浴10 min，冷卻至室溫（25℃），加入10 mL去離子水，于540 nm處測定吸光度，以阿卡波糖為陽性對照組。各組重復測定3次，酶活性抑制率按式3計算。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆花青素的精制工藝優(yōu)化

2.1.1 大孔吸附樹脂優(yōu)選

不同大孔吸附樹脂對黑豆花青素的吸附率和解吸率見圖1。

由圖1可見，對黑豆花青素吸附率和解吸率最高的是XR6702型樹脂，分別達到91.93%和85.74%，顯著高于其他5種大孔吸附樹脂，XR6702型樹脂的極性、顆?？讖郊俺叽邕m合，對黑豆花青素的吸附能力和解吸能力強于AB-8和D101[24-25]。因此本論文選用XR6702型樹脂精制黑豆花青素。

圖1 大孔樹脂型號對黑豆花青素吸附率和解吸率的影響Fig.1 The adsorption and desorption of microporous adsorbent resins on black soybean anthocyanins

2.1.2 樹脂吸附和解吸平衡曲線

XR6702樹脂吸附和解吸平衡曲線如圖2所示。

圖2 吸附和解吸平衡曲線Fig.2 The equilibrium curve of static adsorption and desorption

由圖2可見，黑豆花青素的吸附率和解吸率先增加后平緩，180 min后，吸附率變化平緩，趨于飽和，吸附率最高為91.94%；150 min后，解吸率幾乎不變，黑豆花青素完全解離，解吸完成，解吸率最高為85.77%。

2.1.3 黑豆花青素濃度對吸附率的影響

黑豆花青素濃度對吸附率的影響見圖3。

由圖3可見，吸附率隨黑豆花青素濃度的增加，先增加后減少，吸附率最大值為90.83%，此時黑豆花青素濃度為2.0 mg/mL，濃度過高，容易引起樹脂孔隙堵塞，超出吸附負荷，導致吸附率下降。

2.1.4 吸附液pH值對黑豆花青素吸附率的影響

吸附液pH值對黑豆花青素吸附率的影響見圖4。

圖3 黑豆花青素濃度對吸附率的影響Fig.3 The effect of various concentrations of black soybean anthocyanins on adsorption rate

圖4 吸附液pH值對黑豆花青素吸附率的影響Fig.4 The effect of sample pH on adsorption rate of black soybean anthocyanins

由圖4可見，吸附率最高為90.84%，此時的pH值為3.0，隨pH值繼續(xù)增大，黑豆花青素的吸附率呈現(xiàn)下降趨勢，酸性條件下黑豆花青素趨于穩(wěn)定，吸附率較高[26]，因此后續(xù)柱層析吸附液的pH值調(diào)整為3.0上柱。

2.1.5 乙醇濃度對黑豆花青素解吸率的影響

乙醇濃度對黑豆花青素解吸率的影響見圖5。

圖5 乙醇濃度對黑豆花青素解吸率的影響Fig.5 The effect of ethanol concentration on desorption rate of black soybean anthocyanins

由圖5可見，解吸率最高為85.34%，此時乙醇濃度為60%，黑豆花青素含量最高，解吸率此后出現(xiàn)下降趨勢。洗脫液選定為60%濃度的乙醇。

2.1.6 解吸液pH值對黑豆花青素解吸率的影響

解吸液pH值對黑豆花青素解吸率的影響見圖6。

圖6 洗脫液pH值對黑豆花青素解吸率的影響Fig.6 The effect of mobile phase pH on desorption rate of black soybean anthocyanins

由圖6可見，黑豆花青素的解吸率出現(xiàn)最大值，達到85.15%，此時pH值為4.0，此后pH值繼續(xù)增大，解吸率呈現(xiàn)下降的趨勢。調(diào)整解吸液的pH值為4.0。

2.1.7 洗脫流速對黑豆花青素解吸率的影響

洗脫流速對黑豆花青素解吸率的影響見圖7。

圖7 解吸流速對黑豆花青素解吸率的影響Fig.7 The effect of flow velocity on desorption rate of black soybean anthocyanins

由圖7可見，洗脫流速在0.5 mL/min～3.0 mL/min之間，解吸率先增大后減小，解吸率最大值為87.19%，洗脫流速為1.5 mL/min。因此，1.5 mL/min為最佳洗脫流速。

2.1.8 黑豆花青素精制工藝參數(shù)

黑豆花青素精制選用XR6702型大孔樹脂，裝填于Φ3.5 cm×50 cm層析柱中，吸附條件：原液濃度2 mg/mL，pH 3.0，體積 15 mL，解吸條件：60%乙醇水溶液（pH 4.0），流速1.5 mL/min。黑豆花青素的洗脫曲線如圖8所示。

圖8 黑豆花青素洗脫曲線Fig.8 The elution curve of black soybean anthocyanins

如圖8所示，精制后得到單一黑豆花青素洗脫峰，收集試管（編號25～33）內(nèi)的液體，減壓蒸餾，冷凍干燥，測其黑豆花青素純度為84.92%。

2.2 黑豆花青素的體外降血糖活性

2.2.1 黑豆花青素對α-葡萄糖苷酶活性的影響

黑豆花青素對α-葡萄糖苷酶活性的影響如圖9所示。

圖9 黑豆花青素對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.9 Inhibition activity of black soybean anthocyanins on α-glucosidase

由圖9可見，在質(zhì)量濃度0.5 mg/mL～5.0 mg/mL范圍內(nèi)，黑豆花青素對α-葡萄糖苷酶的活性表現(xiàn)出一定抑制作用，具有較好的劑量效應關系，抑制率最高為 91.36%（5.0 mg/mL），IC50值為 1.65 mg/mL；阿卡波糖的最高抑制率為74.31%，IC50值為1.22 mg/mL。雖然黑豆花青素的IC50值高于阿卡波糖，但相同濃度時表現(xiàn)出的α-葡萄糖苷酶抑制率高于阿卡波糖，高出22.94%。

2.2.2 黑豆花青素對α-胰淀粉酶活性的影響

黑豆花青素對α-胰淀粉酶活性的影響見圖10。

圖10 黑豆花青素對α-胰淀粉酶活性的影響Fig.10 Inhibition activity of black soybean anthocyanins on αamylase

由圖10可見，在質(zhì)量濃度0.5 mg/mL～5.0 mg/mL范圍內(nèi)，黑豆花青素對α-胰淀粉酶的活性表現(xiàn)出一定抑制作用，且具有較好的劑量效應關系，抑制率最高為 89.17%（5.0 mg/mL），IC50值為 3.35 mg/mL；阿卡波糖最高抑制率為71.93%，IC50值為3.67mg/mL。黑豆花青素對α-胰淀粉酶的抑制率高于阿卡波糖，高出23.97%。

3 結(jié)論

本文利用大孔樹脂精制黑豆花青素并評價其降血糖活性。XR6702型大孔吸附樹脂是精制黑豆花青素的最佳樹脂，吸附條件：原液濃度2 mg/mL，pH 3.0，體積15 mL，解吸條件：60%乙醇水溶液（pH 4.0），流速1.5 mL/min，精制后黑豆花青素純度為84.92%；精制后的黑豆花青素對α-葡萄糖苷酶和α-胰淀粉酶的活性都表現(xiàn)出一定的抑制作用，且表現(xiàn)出良好的劑量效應關系，比阿卡波糖組分別提高了22.94%和23.97%，黑豆花青素在體外表現(xiàn)出較好的降血糖活性，關于黑豆花青素的體內(nèi)降血糖活性及作用機制將在后續(xù)課題研究中進行。