亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        醫(yī)用菌株保存方法的研究
        ——以土壤桿菌為例

        2020-08-11 09:20:04姚博偉姚登明
        科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新 2020年25期
        關(guān)鍵詞:脫脂奶粉山梨醇保護(hù)劑

        陳 璐 姚博偉 姚登明

        (1、寧夏師范學(xué)院,寧夏 固原756000 2、寧夏計(jì)量質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究院,寧夏 銀川750000)

        可得然膠是一種重要的食品添加劑,其產(chǎn)生菌株土壤桿菌(Alcaligenes faecalis)最初是由日本的原田篤也(Tokuya Harada)教授于1964 年從土壤中發(fā)現(xiàn)的??傻萌荒z由于具有加熱成膠的特性,也被稱為熱凝膠。日本Takeda 公司對可得然膠的食用安全性進(jìn)行了相關(guān)的研究及評價(jià),研究結(jié)果表明可得然膠無誘變性和致癌性,食用時(shí)不會(huì)導(dǎo)致某些急性慢性疾病的發(fā)生。1989年在美國、日本、韓國及中國臺灣等國家和地區(qū)開始廣泛生產(chǎn)和使用可得然膠,并于1996 年12 月經(jīng)美國FDA 批準(zhǔn)可得然膠可以作為增稠劑、穩(wěn)定劑等直接用于食品工業(yè)中,2006 年6 月我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)可得然膠作為食品添加劑應(yīng)用于食品中。

        隨著我國食品產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,可得然膠產(chǎn)生菌株得到了廣泛的應(yīng)用,因此該菌株的保藏是一項(xiàng)非常重要的工作。目前常用的菌種保藏方法有斜面瓊脂低溫保存、液體石蠟保存、真空冷凍干燥保存及液氮超低溫保存[1,2],而真空冷凍干燥保存技術(shù)相較于其它保藏方法具有低溫、干燥及真空的優(yōu)良條件,能夠有效地使細(xì)胞處于基本休眠狀態(tài),并一定程度內(nèi)抑制生長繁殖,從而降低菌種的死亡率及變異率,現(xiàn)已得到廣泛的應(yīng)用。但是如果直接用菌液凍干保存,其存活率非常低,由于保護(hù)劑可以盡可能的保護(hù)其生物活性和生理生化特性,從而減輕冷凍干燥過程中對菌體的損害[3],因此添加不同保護(hù)劑以提高凍存效率是關(guān)鍵。

        本文以實(shí)驗(yàn)室保存的一株土壤桿菌714 為研究對象,采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),對各類保護(hù)劑進(jìn)行篩選并優(yōu)化出最佳的保護(hù)劑配方,從而最大程度地減少凍存對菌種產(chǎn)生的傷害,提高菌種的存活率,并保持良好的產(chǎn)可得然膠的性能,以期更好的應(yīng)用于食品工業(yè)中。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)設(shè)備

        1.1.1 菌株

        土壤桿菌(Alcaligenes faecalis)714,由華東師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        (1)種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl 10,pH=7.2,121 °C 滅菌20 min 備用。(2)計(jì)數(shù)培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基中添加2%瓊脂粉;(3)保護(hù)劑溶液配制:根據(jù)質(zhì)量比配制各種保護(hù)劑溶液。

        1.1.3 主要試劑與儀器

        1.1.3.1 試劑:市售食品級脫脂乳粉、麥芽糊精,蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、甘油,所用試劑均為生化級,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)。

        1.1.3.2 儀器:GNP-9160 型隔水恒溫培養(yǎng)箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DL-CJ-2NDI 型超凈工作臺,北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;BL-100A 型立式壓力蒸汽滅菌器,上海博訊實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;超低溫冰箱,遼寧瀚瓏廷生物科技有限公司;CR-21N 高速冷凍離心機(jī),上海賽默飛生物有限公司;真空冷凍干燥機(jī),寧波新之生物科技有限公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 實(shí)驗(yàn)流程: 菌種活化→離心收集菌體→生理鹽水清洗菌體→加入不同凍干保護(hù)劑→分裝安瓿管→預(yù)凍→真空冷凍干燥→凍干菌粉→復(fù)水→活菌計(jì)數(shù)→計(jì)算存活率。

        1.2.2 菌種活化及菌懸液的制備

        從斜面上刮取一環(huán)新鮮的菌種接入到種子培養(yǎng)基中,250r/min,30℃培養(yǎng)16h,取等量種子液于無菌離心管中,10000r/min 離心5min,棄上清,菌體用無菌生理鹽水清洗兩次,10000r/min 離心5min,用等體積不同保護(hù)劑溶液重懸菌體,制成菌懸液,取樣計(jì)數(shù),并吸取菌懸液分裝至無菌的安瓿管中,每管300ul。

        1.2.3 冷凍干燥

        將分裝有菌液的安瓿管置于-80℃冰箱中預(yù)凍2h,然后迅速將徹底凍結(jié)的菌液轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)中,啟動(dòng)凍干程序進(jìn)行抽真空干燥,冷凍干燥24h。

        1.2.4 凍干前細(xì)胞總數(shù)的測定

        吸取100μL 菌液用無菌水10 倍梯度稀釋,選擇合適的稀釋梯度,吸取100μL 菌懸液涂布于計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上,每個(gè)梯度做3 個(gè)平行,將平板放入恒溫培養(yǎng)箱中,30℃倒置培養(yǎng),待菌落長出后,計(jì)數(shù),根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算原菌懸液中的細(xì)胞總數(shù)。

        1.2.5 凍干存活率的測定

        向凍干后的各菌粉中加入等體積無菌水,充分溶解混勻后,梯度稀釋涂布計(jì)數(shù),凍干后細(xì)胞存活率計(jì)算式如下:

        凍干存活率(%)=每ml 菌懸液凍干后存活細(xì)胞數(shù)/凍干前每ml 菌懸液中的細(xì)胞總數(shù)X100%

        1.2.6 單一保護(hù)劑的選擇

        1.2.6.1 保護(hù)劑的篩選

        菌株714 用種子培養(yǎng)基活化后,離心收集菌體,用各種保護(hù)劑溶液重懸菌體,真空干燥機(jī)中凍干,稀釋涂布,計(jì)算存活率。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4-7],本文中所選用的凍干保護(hù)劑種類及濃度如表1 中所示。

        表3 正交試驗(yàn)因素及水平

        表1 保護(hù)劑種類及濃度

        1.2.6.2 凍干保護(hù)劑濃度的優(yōu)化

        分別選取各類保護(hù)劑中保護(hù)效果最好的保護(hù)劑對其濃度進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)中所選用的保護(hù)劑種類及濃度如表2 中所示。

        表2 保護(hù)劑濃度

        1.2.6.3 復(fù)合保護(hù)劑的選擇

        根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,從各大類保護(hù)劑中分別選出一種保護(hù)效果好的保護(hù)劑,利用正交設(shè)計(jì)軟件,采用L9(33)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3。

        1.2.6.4 數(shù)據(jù)分析

        用Excel2013、Graphpad prism7.0 及正交設(shè)計(jì)助手II 對結(jié)果進(jìn)行分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 保護(hù)劑的篩選

        選用糖類、醇類和大分子類共11 種常用的保護(hù)劑,考查在菌株714 凍干過程中的保護(hù)效果。從表4 結(jié)果可以看出,在糖類物質(zhì)中,海藻糖對菌體具有較好的保護(hù)效果,其存活率為36.7%,在多元醇中,山梨醇較甘油及甘露醇保護(hù)效果好,大分子物質(zhì)脫脂奶粉保存效果相對較好,綜合上述結(jié)果,選用海藻糖、山梨醇及脫脂乳粉作為凍干保護(hù)劑,進(jìn)行下一步單因素試驗(yàn)。

        表4 不同保護(hù)劑對菌株凍存的影響

        2.2 凍干保護(hù)劑濃度的優(yōu)化

        2.2.1 脫脂奶粉濃度優(yōu)化

        圖1 為脫脂奶粉濃度對菌株凍存的影響??梢钥闯?,脫脂奶粉對菌體具有一定的保護(hù)效果,且脫脂奶粉濃度不同時(shí)存活率也有所差異。當(dāng)脫脂奶粉濃度低于15%時(shí),隨著脫脂奶粉濃度的增加,存活率逐漸增加;當(dāng)脫脂奶粉濃度為15%時(shí),存活率最高,為32.5%。當(dāng)脫脂奶粉濃度大于15%時(shí),存活率有所下降。這可能是在菌種凍存中脫脂奶粉能減少細(xì)胞暴露于氧氣和介質(zhì)中的面積,同時(shí)乳清蛋白能在菌體表面形成蛋白膜,對細(xì)胞進(jìn)行保護(hù),并可固定凍干酶類,減少由于細(xì)胞壁損壞而引起的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏,從而起到較好的保護(hù)作用[8],另外,脫脂奶粉中含有的乳糖也能起到保護(hù)的作用[9]。

        圖1 脫脂奶粉濃度對菌株凍存的影響

        2.2.2 海藻糖濃度優(yōu)化

        圖2 為海藻糖濃度對菌株凍存的影響。當(dāng)海藻糖濃度為4%時(shí),保護(hù)效果最好,存活率最高為65.2%,隨著海藻糖濃度的增加,菌株存活率逐漸降低。海藻糖相較于脫脂奶粉表現(xiàn)出明顯的保護(hù)優(yōu)勢,其凍干后最高存活率可達(dá)到脫脂奶粉的近2 倍。其原因可能是海藻糖具有較大的水化體積,能競爭更多的蛋白質(zhì)水化層中的水,使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更為緊密,不易受到外界不利環(huán)境的影響,且在同等條件下,海藻糖顯示了最高的玻璃化相轉(zhuǎn)變溫度,表現(xiàn)出優(yōu)越的保護(hù)效果[5],另外由于海藻糖分子較小,容易進(jìn)入蛋白質(zhì)分子的空隙中,一定程度上抑制了蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化,從而有效地避免了蛋白質(zhì)變性失活[10]。

        圖2 海藻糖濃度對菌株凍存的影響

        2.2.3 山梨醇濃度優(yōu)化

        圖3 為山梨醇濃度對菌株凍存的影響。隨著山梨醇濃度的增加,菌株存活率也逐漸增加,當(dāng)山梨醇濃度為7%時(shí),保護(hù)效果最好,存活率最高為43.9%;當(dāng)山梨醇濃度大于7%時(shí),存活率略有下降。這可能是由于山梨醇可以和細(xì)菌的細(xì)胞膜發(fā)生相互作用,一定程度上對細(xì)胞膜起到保護(hù)作用,另外還可以和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)之間形成氫鍵,穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性及相關(guān)功能特性,從而對菌體起到保護(hù)作用[11]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道山梨醇在乳酸菌凍存中也有較好的保護(hù)效果[12]。

        圖3 山梨醇濃度對菌株凍存的影響

        2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化菌種凍干保護(hù)劑

        根據(jù)上述單因素試驗(yàn)對保護(hù)劑的篩選,得到脫脂奶粉、山梨醇及海藻糖對菌種凍干有較好的保護(hù)效果,且最優(yōu)保護(hù)劑濃度依次為10%、7%及4%。但是單一的保護(hù)劑凍干存活率相對較低,因此在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)合保護(hù)劑的效果。用正交設(shè)計(jì)軟件助手設(shè)計(jì)了三因素三水平L9(33)的正交試驗(yàn),以菌株的存活率為評價(jià)指標(biāo),結(jié)果見表5。

        表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

        由極差R 可以判斷,對菌種凍存后存活率的影響程度依次為脫脂奶粉>山梨醇>海藻糖。從存活率可以看出,當(dāng)組合為脫脂奶粉10%、山梨醇5%、海藻糖1%時(shí),保護(hù)效果最好,此時(shí)存活率為87.2%,大于任一單一因素的存活率,優(yōu)化效果明顯。通過表6 中的方差分析表明,脫脂奶粉的F 值大于F 臨界值,說明脫脂奶粉對菌體凍存具有顯著性的影響,因此極差分析和方差分析結(jié)果一致。

        表6 顯著性分析

        3 結(jié)論

        試驗(yàn)表明,菌種在真空冷凍干燥過程中,添加保護(hù)劑對菌體存活率有很大的影響。通過單因素試驗(yàn)從糖類、多元醇類及大分子類共11 種物質(zhì)中分別篩選得到海藻糖、山梨醇及脫脂奶粉對菌株凍干有較好的保護(hù)效果,且最優(yōu)保護(hù)劑濃度依次為4%、7%及15%。正交試驗(yàn)得到土壤桿菌存活率最高的保護(hù)劑配方為:脫脂奶粉10%、山梨醇5%、海藻糖1%,凍干后菌株的存活率可達(dá)87.2%,大于任一單一因素的存活率,優(yōu)化效果明顯。極差R 顯示,對菌種凍存后存活率的影響程度依次為脫脂奶粉>山梨醇>海藻糖。脫脂奶粉是一種由蛋白質(zhì)、乳糖、鹽類、維生素類等形成的混合物,由于凍干后的菌粉呈較輕的多孔無定性結(jié)構(gòu),容易復(fù)水[11],使其在菌種凍存中具有廣泛的應(yīng)用。脫脂奶粉單獨(dú)作為保護(hù)劑時(shí)凍干后的存活率較低,一般都是與其他保護(hù)劑復(fù)配來提高菌種凍干存活率[13]。本文也通過脫脂奶粉與其他保護(hù)劑的復(fù)配得到了保護(hù)效果良好的配方,為可得然膠產(chǎn)生菌株的保藏及工業(yè)化生產(chǎn)具有積極的作用。

        猜你喜歡
        脫脂奶粉山梨醇保護(hù)劑
        D-山梨醇醚化過程的熱力學(xué)計(jì)算與分析
        凍干益生菌微膠囊保護(hù)劑及抗性研究
        中國飼料(2021年17期)2021-11-02 08:15:14
        非均相催化法制備異山梨醇的研究現(xiàn)狀
        石油化工(2021年9期)2021-10-18 02:14:16
        全球脫脂奶粉價(jià)格變化趨勢
        如何改善脫脂奶粉的沖調(diào)性
        中國食品(2019年1期)2019-09-10 00:06:33
        微流控法低溫保護(hù)劑添加及去除線型優(yōu)化研究
        第211次GDT拍賣:脫脂奶粉上漲3.6%,全脂奶粉下降1.5%
        山梨醇類成核劑對改性聚丙烯發(fā)泡性能的影響
        中國塑料(2016年5期)2016-04-16 05:25:42
        低溫保護(hù)劑熱物性分析與冰晶的顯微研究
        美國FDA考慮修訂若干乳制品的識別標(biāo)準(zhǔn)要求
        国产精品久久久久免费观看| 亚洲在中文字幕乱码熟女| 国产色av一区二区三区| 国产熟妇与子伦hd| 久久精品无码中文字幕| 天堂最新在线官网av| 日本一级三级在线观看| 亚洲日韩小电影在线观看| 性色av无码一区二区三区人妻| 欧美日韩国产成人综合在线影院 | 亚洲一区二区视频免费看| 亚洲av无码国产精品久久| 久久综合九色综合网站| 中文字幕亚洲人妻系列| 中文字幕久久精品一区二区| 男女18禁啪啪无遮挡激烈网站| 欧美性开放bbw| 最新在线观看精品国产福利片| 人妖啪啪综合av一区| 国产特级毛片aaaaaa视频| 日本高清一区二区三区水蜜桃| 挑战亚洲美女视频网站| 日本一区二区三区四区高清不卡| 天堂新版在线资源| 久久久伊人影院| 人妖系列在线免费观看| 少妇无码太爽了在线播放| 疯狂做受xxxx高潮欧美日本| 亚洲国产字幕| 国产成人国产三级国产精品| 狠狠躁天天躁中文字幕| 久久精品无码一区二区乱片子| 91中文字幕精品一区二区| 亚洲综合网国产精品一区| 精品福利视频一区二区三区| 97人妻无码免费专区| 国产毛片av一区二区| 天天影视性色香欲综合网| 中字亚洲国产精品一区二区| 亚洲免费在线视频播放| 人妻少妇乱子伦精品无码专区电影|