顏常盛

（核工業(yè)二七〇研究所，南昌330200）

已報(bào)道的蛋白質(zhì)測(cè)定方法很多， 如凱氏定氮法、 雙縮脲法、 酚試劑法和紫外吸收法等［1-5］，主要可分為間接法和直接法兩類，較為經(jīng)典的間接法為凱氏定氮法。 利用凱氏定氮法測(cè)量蛋白質(zhì)含量時(shí)， 催化劑和濃硫酸使蛋白質(zhì)中的碳?xì)浠衔锉谎趸?生成二氧化碳和水而逸出， 氮元素則轉(zhuǎn)化為氨根， 與硫酸根結(jié)合形成硫酸銨，存于消解液當(dāng)中［6-7］。在強(qiáng)堿環(huán)境中， 對(duì)消解液進(jìn)行蒸汽加熱， 使硫酸銨分解， 生成的氨氣隨水蒸氣蒸餾出來(lái)被過(guò)量的硼酸液吸收， 最后用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定， 測(cè)定試樣中的氮含量，通過(guò)系數(shù)折算出蛋白質(zhì)含量。

豆類是一類高蛋白、 高脂肪、 高碳水化合物的農(nóng)作物， 主要可分為兩大類： 粗蛋白含量較高的豆類， 如黃豆和黑豆； 碳水化合物含量較高的豆類，如紅豆、赤豆和綠豆等。目前對(duì)于豆類粗蛋白含量的分析， 僅停留在對(duì)大豆和大豆制品的蛋白含量研究層面， 而對(duì)于其他豆類粗蛋白的分析測(cè)定基本上為空白。 全自動(dòng)凱氏定氮儀的興起， 使各類領(lǐng)域內(nèi)的分析人員， 在如何精準(zhǔn)、 快速測(cè)定物質(zhì)蛋白質(zhì)含量的技術(shù)上做各種條件優(yōu)化試驗(yàn)，為大批量、 高效率地測(cè)定蛋白含量， 提供了有力的技術(shù)指導(dǎo)［8-9］。

本試驗(yàn)以大豆、 黑豆、 赤豆和綠豆4 種常見(jiàn)的豆類為例， 利用全自動(dòng)凱氏定氮儀較為全面地分析影響豆類粗蛋白含量測(cè)定的因素。 以樣品質(zhì)量、 硫酸添加量、 消化溫度和消解時(shí)間為試驗(yàn)變量， 通過(guò)單一變量試驗(yàn)和正交試驗(yàn)， 建立不同種類豆類粗蛋白的最優(yōu)分析試驗(yàn)?zāi)Ｐ停?為豆類蛋白質(zhì)的測(cè)定， 提供既高效又精準(zhǔn)的技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

HF1×100 g 型全密封制樣粉碎機(jī)， 購(gòu)置于浙江豐利公司；BSA224A-CW 型萬(wàn)分之一天平，購(gòu)置于賽多利斯公司；K1100 型全自動(dòng)凱氏定氮儀、SH220F 型石墨消解爐購(gòu)置于海能儀器廠。

1.2 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)選用粗蛋白含量跨度較大的4 種常見(jiàn)的豆類農(nóng)作物， 包括大豆、 黑豆、 赤豆和綠豆。濃硫酸（1.84 g·mL-1）、氫氧化鈉溶液（400 g·L-1）、硼酸吸收液 （20 g·L-1）、硼砂標(biāo)準(zhǔn)滴定液 （0.039 8 mol·L-1）、 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.105 4 mol·L-1）、甲基紅乙醇溶液（0.1%）和溴甲酚綠的乙醇溶液 （0.1%）， 定氮催化片（K2SO4∶CuSO4＝3.6∶0.4）、 石蠟油和硫酸銨，以上實(shí)驗(yàn)所用試劑純度均為分析純， 實(shí)驗(yàn)用水均為去氨蒸餾水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

樣品的制備：取4 種豆籽各200 g，進(jìn)行洗滌、 晾干后， 經(jīng)粉碎機(jī)粉粹， 過(guò)篩80 目，置于磨口瓶中備用。

樣品的消解： 稱取適量的4 種豆籽粉碎樣， 置于消化管中， 加入一粒催化片、 適量體積的濃硫酸， 將消化管置于多孔石墨消解儀上對(duì)豆粉進(jìn)行消解。

樣品的蒸餾： 啟動(dòng)全自動(dòng)凱氏定氮儀，待儀器調(diào)整至穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)， 將消化管固定在定氮儀上， 并在界面窗口上輸入具體分析參數(shù)（硼酸：25 mL，稀釋水30 mL， 加堿量：40 mL， 蛋白系數(shù)：6.25， 蒸汽流量：100%，蒸餾時(shí)間5 min， 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液溶度：0.105 4 mol·L-1）。

3 結(jié)果與討論

3.1 稱樣量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

目前， 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)只給整個(gè)豆類品種的大概稱樣量（0.2～2.0 g），對(duì)于粒徑尺寸均一的樣品， 適當(dāng)?shù)卦黾臃Q樣量， 能夠一定程度地降低系統(tǒng)誤差，但耗時(shí)長(zhǎng)，消耗的硫酸量大。而減少稱樣量時(shí)， 消解時(shí)間縮短， 但又難于保證結(jié)果的精確度和準(zhǔn)確度。 為此確定特定某一種的豆類合理的稱樣量對(duì)分析結(jié)果具有十分重要的意義。

固定硫酸添加量為10.00 mL， 消解溫度為420 ℃，消解時(shí)間為90 min，催化劑1 片，考察4 種豆籽粉粹樣在不同質(zhì)量下， 消解后的粗蛋白質(zhì)含量結(jié)果，見(jiàn)圖1。

由圖1 可見(jiàn)，4 種豆類蛋白質(zhì)含量隨樣品稱樣量的變化出現(xiàn)了不同程度的變化， 不同種類的豆類其最佳稱樣量也有所不同（大豆：0.20 ～0.40 g， 黑 豆： 0.40 ～0.60 g， 綠 豆：0.40～0.70 g， 赤豆： 0.20～0.40 g）， 為此，在測(cè)定豆類蛋白含量時(shí)， 應(yīng)將稱樣量控制在0.30～0.60 g 之間，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

3.2 硫酸添加量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

圖1 樣品稱樣量對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)量結(jié)果的影響Fig.1 Effect of sample weighting on protein measurement results

消解豆籽粉粹樣時(shí)，在催化劑的作用下，濃硫酸能夠破壞豆籽結(jié)構(gòu)中的蛋白大分子以及有機(jī)氮化物 （催化劑中的K2SO4與H2SO4形成的KHSO4提高溶液沸點(diǎn)，CuSO4用于判斷消解終點(diǎn)）， 使N 元素以游離的NH4SO4存在于消解液中。 過(guò)量地使用濃硫酸容易造成溫度過(guò)高， 使銨鹽分解， 分析結(jié)果偏低， 并且浪費(fèi)資源； 而減少濃硫酸的使用， 容易引起消解不完全， 使得分析結(jié)果不準(zhǔn)確， 為此，尋找最佳濃硫酸用量， 對(duì)確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和環(huán)境保護(hù)具有深刻意義。

固定稱樣量為0.4 g，消解溫度為420 ℃，消解時(shí)間為90 min， 催化劑1 片， 考察不同濃硫酸 添 加 量（2、4、6、8、10、12、14 和16 mL）對(duì)4 種豆籽粗蛋白測(cè)定的影響， 見(jiàn)圖2。

圖2 硫酸添加量對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)量結(jié)果的影響Fig.2 Effect of concentrated sulfuric acid addition on protein measurement

由圖2 可知，由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在4種豆籽樣品中， 硫酸添加量嚴(yán)重影響樣品的消解程度， 硫酸用量不足時(shí)， 樣品消解不完全， 體現(xiàn)在測(cè)得的粗蛋白含量低于正常值，硫酸添加過(guò)量時(shí)， 樣品消解過(guò)于徹底， 粗蛋白含量測(cè)得值出現(xiàn)不同程度的降低， 這是由于消解溫度過(guò)高，部分銨鹽發(fā)生了分解，引起蛋白含量的偏低， 用于消解大豆樣品的最佳硫酸添加量為6～10 mL， 黑豆為8～10 mL，赤豆為6～12 mL，綠豆為8～12 mL，不同的豆籽樣品有著不同的最佳硫酸添加范圍， 這是由4 種豆類種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異造成的。綜上所述，當(dāng)豆類粉碎樣在0.4 g 時(shí)，最佳硫酸用量為8～12 mL。

3.3 消解溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

在消解豆籽樣品時(shí)， 由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜， 石墨爐的消解溫度往往需要設(shè)置在400 ℃以上，而常用的消解酸中，以硫酸沸點(diǎn)最高為338 ℃（過(guò)氧化氫：105 ℃、硝酸：122 ℃、高氯酸：203 ℃）， 因此選擇硫酸作為消解酸液。 為了使樣品充分的消解和氮元素徹底的釋放， 研究人員通常采用程序升溫的來(lái)處理樣品。

參照程序升溫的步驟 （階段1：230 ℃保持20 min，階段2：350 ℃保持20 min，階段3：420 ℃保持90 min），在不改變階段1、階段2 的升溫過(guò)程及階段3 的保持時(shí)間（90 min）情況下，改變階段3 的保持溫度。固定樣品質(zhì)量0.40 g，10.00 mL 濃硫酸，1 片催化劑，考察不同的消解溫度（360、380、400、420、440、460和480 ℃）對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響，見(jiàn)圖3。

圖3 消解溫度對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)量結(jié)果的影響Fig.3 Effect of digestion temperature on protein measurement results

由圖3 可知，當(dāng)消解溫度低于400 ℃時(shí)，4 種豆籽樣品的蛋白含量隨溫度升高而升高，溫度在420～460 ℃區(qū)間時(shí)，4 種豆籽樣品的蛋白含量趨于穩(wěn)定，溫度高于460 ℃時(shí)，4 種豆籽樣品的蛋白含量出現(xiàn)不同程度的下降，為此，當(dāng)豆類粉碎樣在0.4 g， 硫酸用量為10 mL 時(shí)， 程序加熱3 階段的加熱溫度在420～460 ℃為最佳溫度區(qū)間。

3.4 消解時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

消解時(shí)間是決定樣品是否完全消解的重要因素之一， 石墨消解儀在消解豆籽粉碎樣時(shí)， 國(guó)標(biāo)文件上推薦的時(shí)間為90 min， 而對(duì)于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的豆籽品種， 時(shí)間也未必需要90 min， 必然會(huì)造成資源的浪費(fèi)， 形成的銨鹽，也因此會(huì)分解。反之，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的豆籽，國(guó)標(biāo)規(guī)定的時(shí)間又可能難于滿足消解要求，使分析結(jié)果偏小。 因此， 為了得到準(zhǔn)確的粗蛋白含量， 針對(duì)不同種類豆籽樣品， 探尋最佳的消解時(shí)間至關(guān)重要。 儀器廠家以程序升溫對(duì)樣品進(jìn)行消解。 參照程序升溫的步驟（階段1：230 ℃保持20 min，階段2：350 ℃保持20 min， 階段3： 430 ℃保持90 min），保持階段1 和階段2 的升溫步驟， 固定樣品稱樣量0.4 g， 硫酸添加量8 mL， 催化劑1片，考察階段3 中430 ℃的不同保持時(shí)間，對(duì)粗蛋白含量測(cè)定結(jié)果的影響。

圖4 消解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)量結(jié)果的影響Fig.4 Effect of digestion time on protein measurement results

由圖4 可知， 程序升溫階段3 的加熱時(shí)間控制對(duì)樣品的消解起著至關(guān)重要的作用，維持時(shí)間不足會(huì)導(dǎo)致樣品消解不徹底， 反之時(shí)間過(guò)長(zhǎng)， 會(huì)使得銨鹽分解， 兩種情況都將使得最終測(cè)得的粗蛋白含量偏低。 不同種類的豆籽有著不同的最佳維持時(shí)間，綜合而言，在階段3 中430 ℃保持60～80 min 較為合理。

3.5 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素水平的基礎(chǔ)上， 以大豆中的粗蛋白含量為對(duì)象， 選擇樣品質(zhì)量、 硫酸添加量、 消解時(shí)間和消解溫度進(jìn)行4 因素4 水平的正交試驗(yàn)， 進(jìn)一步優(yōu)化凱氏定氮測(cè)量蛋白質(zhì)含量的條件，交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，方差分析見(jiàn)表2。

表1 交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Cross experiment results

表2 方差分析結(jié)果Table 2 Results of variance analysis

由表1～2 可知， 消解溫度的顯著性為0.006（P＜0.05）和消解時(shí)間的顯著性為0.013（P＜0.05）， 可見(jiàn)消解溫度和消解時(shí)間的控制對(duì)測(cè)定結(jié)果具有顯著影響， 而硫酸添加量的顯著性為0.078（0.05＜0.078＜0.10）， 說(shuō)明硫酸的添加量對(duì)測(cè)定結(jié)果有一定的影響， 而樣品質(zhì)量的大小則對(duì)結(jié)果影響不明顯， 即影響大小為： 消解溫度＞消解時(shí)間＞硫酸添加量＞樣品質(zhì)量， 因此， 當(dāng)稱樣量為0.4 g 時(shí)，消解溫度為430 ℃， 消解時(shí)間為60 min， 硫酸添加量為10 mL 時(shí)， 消解效果最佳， 所測(cè)的粗蛋白含量最大。

4 結(jié)論

以樣品質(zhì)量、 硫酸的添加量、 消解溫度和消解時(shí)間為實(shí)驗(yàn)變量， 針對(duì)性地建立了不同實(shí)驗(yàn)條件、 不同種類豆類的粗蛋白測(cè)量實(shí)驗(yàn)， 得出常見(jiàn)豆籽樣品的最佳處理?xiàng)l件。 在測(cè)定豆籽樣品粗蛋白含量時(shí)， 豆籽樣品的消解溫度和消解時(shí)間的影響最為顯著， 硫酸添加量次之， 樣品質(zhì)量最小， 影響力順序?yàn)椋合鉁囟龋鞠鈺r(shí)間＞硫酸添加量＞樣品質(zhì)量， 得出在測(cè)定常見(jiàn)豆類樣品中粗蛋白量含量時(shí)， 質(zhì)量應(yīng)控制在0.4～0.6 g 之間較為合適， 最佳的消解溫度為430 ℃， 消解時(shí)間為60 min，硫酸添加量為10 mL。較為合理的樣品前處理?xiàng)l件， 在減少了環(huán)境污染節(jié)約資源的同時(shí)， 顯著地提高了豆籽粗蛋白含量的準(zhǔn)確性與精確性， 為進(jìn)一步更為深入地探究豆類樣品的蛋白成分提供了有力的支撐。