高 華,齊會(huì)珍,毛潔萍,楊新玲

(1 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,烏魯木齊 830011;2 新疆烏魯木齊市友誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3 新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院;*通訊作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

癲癇是腦神經(jīng)元異常放電產(chǎn)生的一種腦功能失調(diào)臨床綜合征,以藥物治療為主,但仍有約1/3的癲癇患者在治療后仍有不同類型的發(fā)作,成為耐藥性癲癇。對(duì)于耐藥機(jī)制的探究已成為癲癇研究熱點(diǎn),其中抗癲癇藥物靶分子結(jié)構(gòu)改變是促使藥物敏感性降低的原因之一。含有5個(gè)亞基的GABA(A)受體作為抗癲癇藥物的核心靶點(diǎn)之一,其受體亞基單核苷酸多態(tài)性與癲癇易感性及其耐藥性的聯(lián)系也日益受到關(guān)注。對(duì)癲癇患者的GABA(A)受體亞基基因多態(tài)性進(jìn)行篩查時(shí)發(fā)現(xiàn),其中部分單核苷酸基因多態(tài)性與癲癇或/和其耐藥存在關(guān)聯(lián)性[1,2]。

癲癇與個(gè)體遺傳、種族特點(diǎn)和地域環(huán)境差異有關(guān)[3,4],新疆作為以維吾爾族聚集為主的區(qū)域,具有其特有的種族特異性和地域特點(diǎn)?；诖颂攸c(diǎn),本實(shí)驗(yàn)開展在維吾爾族癲癇患者人群中GABA(A)受體基因多態(tài)性與其癲癇、耐藥癲癇的相關(guān)性研究,旨在為區(qū)域民族癲癇病提供遺傳學(xué)依據(jù)。同時(shí),也有助于早期篩查耐藥性癲癇的高危人群,為個(gè)體化治療的方案及遠(yuǎn)期預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2017-01～2018-08在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院住院或門診確診的85例維吾爾族癲癇患者為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn):①年齡>14歲;②發(fā)作至少有2次且間隔至少24 h以上,病史及腦電圖(electroencephalogrphy,EEG)檢測(cè)支持癲癇診斷;③頭顱CT或MRI檢查排除繼發(fā)性癲癇。根據(jù)2010年國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟的耐藥性癲癇定義[5],85例癲癇患者包括耐藥性癲癇32例,非耐藥性癲癇53例。正常對(duì)照組90例,均來(lái)自同時(shí)期體檢正常的維吾爾族(無(wú)發(fā)作記錄)。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)討論通過(guò),入選人員均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采集所有入選者靜脈血2 ml,DNA提取試劑盒(天根基離心柱型)進(jìn)行全組DNA的提取,提取過(guò)程及步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) GABA(A)受體基因rs211037,rs201987位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)由上海生工生物合成。引物序列見表1。依據(jù)設(shè)計(jì)的引物序列,進(jìn)行進(jìn)一步的PCR擴(kuò)增。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.3 測(cè)序 對(duì)GABA(A)受體基因rs211037,rs201987基因位點(diǎn),選取各樣品的PCR產(chǎn)物10 μl進(jìn)行直接測(cè)序(上海生工生物公司完成)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料的比較

癲癇病例組與對(duì)照組在性別、年齡因素均衡性分析后,兩組間一般資料對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,基線一致(P>0.05,見表2)。

表2 各組一般資料比較Table 2 Comparison of general clinical data between different groups

2.2 遺傳平衡檢驗(yàn)

癲癇組和對(duì)照組人群中GABA(A)受體基因rs211037(χ2=2.751,P>0.05),rs201987(χ2=0.933,P>0.05)位點(diǎn)的遺傳平衡狀態(tài)符合Hardy Weinberg定律。

2.3 GABA(A)受體基因rs211037,rs201987位點(diǎn)PCR擴(kuò)增及直接測(cè)序分析

rs211037,rs201987兩個(gè)基因位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物,目的片段大小分別在566 bp和417 bp處可以獲得(見圖1)。rs211037,rs201987位點(diǎn)直接測(cè)序圖:樣本表達(dá)為CC、CT、TT三種不同基因分型(見圖2)。

圖1 rs211037,rs201987位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Electrophoresis of PCR amplification products at rs211037,rs201987

圖2 rs211037,rs201987位點(diǎn)基因分型Figure 2 Genotyping of rs211037 and rs201987

2.4 rs211037,rs201987位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在病例組和對(duì)照組的分布

病例組和正常對(duì)照組的兩組間的GABA(A)基因rs211037,rs201987位點(diǎn)均存在有CC、CT、TT三種基因類型。病例組中rs211037位點(diǎn)CC基因型頻率和C等位基因頻率變化與對(duì)照組相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.218,P>0.05;χ2=0.155,P>0.05);其rs201987位點(diǎn)的CC基因型頻率和C等位基因頻率在病例對(duì)照兩組間也存在差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.057,P>0.05;χ2=0.161,P>0.05,見表3,4)。

表3 rs211037位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率在病例組與對(duì)照組的分布 次(%)Table 3 Distribution of genotype frequency and allele frequency of rs211037 site in case group and control group cases(%)

表4 rs211037位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率在病例組與對(duì)照組的分布 次(%)Table 4 Distribution of genotype frequency and allele frequency of rs201987site in case group and control group cases(%)

2.5 rs211037,rs201987位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在癲癇耐藥組和非耐藥組的分布

在進(jìn)行癲癇耐藥組和非耐藥組間的GABAARG2基因rs211037,rs201987位點(diǎn)分析,不論是在CC基因型頻率的比較,還是在C等位基因頻率的比較,兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.009,P>0.05;χ2=3.089,P>0.05;χ2=0.339,P>0.05;χ2=0.564,P>0.05,見表5,6)。

表5 癲癇耐藥組和非耐藥組rs211037位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率的分布 次(%)Table 5 Distribution of genotype frequency and allele frequency of rs211037 in in drug resistance group and drug-response group cases(%)

表6 癲癇耐藥組和非耐藥組rs201987位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率的分布 次(%)Table 6 Distribution of genotype frequency and allele frequency of rs201987 in drug resistance group and drug-response group cases(%)

3 討論

癲癇發(fā)生的其中一重要的病理生理機(jī)制被認(rèn)為是腦內(nèi)興奮性遞質(zhì)谷氨酸(Glu)和抑制性遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)的遞質(zhì)失衡學(xué)說(shuō),目前認(rèn)為癲癇的發(fā)作與GABA介導(dǎo)的抑制性突觸電活動(dòng)降低有關(guān)[6-10]。GABA與GABA(A)受體結(jié)合后,可以促使Cl-內(nèi)流產(chǎn)生抑制性突觸后電位,減少或抑制神經(jīng)元的放電達(dá)到細(xì)胞穩(wěn)態(tài)化。故GABA(A)受體編碼基因改變時(shí),可能導(dǎo)致GABA(A)受體結(jié)構(gòu)變化或敏感性下降,造成癲癇發(fā)生,或者在抗癲癇藥物使用中,造成藥物敏感度下降而產(chǎn)生耐藥性癲癇。

目前研究表明,GABA(A)受體的功能狀態(tài)和癲癇發(fā)病有著密切聯(lián)系。在以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,Richter等[11]體外培養(yǎng)的大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞中,可以通過(guò)GABA(A)受體上調(diào)使神經(jīng)元電活動(dòng)減弱。Gasior等[12]也發(fā)現(xiàn)在對(duì)抗戊四氮(Pentetrazol,PTZ)誘導(dǎo)的大鼠癲癇發(fā)作時(shí),可以通過(guò)加奈索酮特異性地上調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GABA(A)受體的表達(dá)而完成。與此同時(shí),在對(duì)癲癇患者研究中也發(fā)現(xiàn),GABA(A)受體基因的多態(tài)性也是造成癲癇產(chǎn)生和耐藥癲癇產(chǎn)生的因素之一):Gurba等[13]聲稱兒童失神癲癇與GABA(A)受體β3亞基的突變G32R有關(guān)。Wallace等[5]在一個(gè)以熱性驚厥和失神癲癇為主要發(fā)作形式的家系中發(fā)現(xiàn)了GABA(A)受體γ2亞基的突變R43Q。Ding等[14]發(fā)現(xiàn)青少年肌陣攣性癲癇中有GABA(A)受體亞基的突變導(dǎo)致其受體表達(dá)減少。在關(guān)于耐藥癲癇研究中,Kim等[15]發(fā)現(xiàn)GABRA的rsl2658835和rs35166395位點(diǎn)多態(tài)性與耐藥癲癇存在相關(guān)性。Kumari等[16]也發(fā)現(xiàn)GABRA的rs2279020與癲癇易感性和耐藥性有關(guān)。然而Kinirons等[17]發(fā)現(xiàn)在愛爾蘭地區(qū)人群癲癇患者中rs2279020位點(diǎn)多態(tài)性與耐藥性癲癇并無(wú)相關(guān)性,此結(jié)論與曹宇澤等[18]在中國(guó)漢族癲癇人群的研究結(jié)果相同。因此,綜合來(lái)說(shuō)對(duì)于GABA(A)受體基因多態(tài)性的結(jié)論也并非一致。本試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),GABA(A)受體基因rs211037,rs201987位點(diǎn)在所有入選病例中都存在有CC、CT、TT三種基因型表達(dá)。rs211037,rs201987基因位點(diǎn)不論在癲癇病例組和正常對(duì)照組之間,以及癲癇的耐藥性和非耐藥性分組中,它們的CC基因型頻率和C等位基因頻率的分布概率,差異均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),從本次研究結(jié)論提示,GABA(A)基因rs211037,rs201987位點(diǎn)多態(tài)性在新疆維吾爾族人群和其癲癇病易感性無(wú)關(guān)聯(lián),并且與癲癇耐藥性也無(wú)關(guān)聯(lián)性。本研究結(jié)論中與既往對(duì)癲癇漢族人群[18]及愛爾蘭癲癇人群[17]研究結(jié)論相似,均為陰性。

本試驗(yàn)結(jié)果未能提示在新疆地區(qū)維吾爾族人群中GABA(A)受體基因多態(tài)性與癲癇有關(guān),也未發(fā)現(xiàn)與癲癇耐藥性相關(guān)。分析可能的因素,一方面樣本量的大小,另一方面癲癇的不同發(fā)作形式,同時(shí)癲癇本身遺傳學(xué)特點(diǎn)可能也是造成目前陰性結(jié)果的相關(guān)原因。這有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、以不同種族、地域以及多中心的多基因位點(diǎn),進(jìn)行更多的驗(yàn)證,提高結(jié)論的一致性。