程忠強,蔣成義,詹曉東

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,蚌埠 233003;*通訊作者,E-mail:zxdent2007@aliyun.com)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是中國高發(fā)惡性腫瘤之一,發(fā)病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首。NPC早期癥狀不明顯,但其惡性程度高,早期可發(fā)生局部淋巴結轉(zhuǎn)移甚至遠處轉(zhuǎn)移,約70%患者確診時已進入中晚期,多預后差[1,2]。目前臨床治療NPC多以手術切除結合放療和(或)輔助化療為主,但大多患者對放療中度敏感且會引起全身后遺癥,而約75%患者會出現(xiàn)化療耐藥性,臨床效果不佳[3,4],因此急需尋找新型治療藥物。木犀草素(luteolin,LUT)是一種天然的四羥基黃酮化合物,在多種藥用植物中廣泛存在,具有消炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性,在結腸癌[5]、肝癌[6]、乳腺癌[7]等多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用,但對NPC的作用尚少有研究。研究發(fā)現(xiàn)[8-10],磷脂酰肌醇-3-羥基激酶(PI3K)通路與NPC高分化細胞株CNE-1增殖、遷移和侵襲密切相關,而腫瘤侵襲、遷移過程中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)機制又發(fā)揮重要作用。基于此,本研究擬通過探究LUT靶向PI3K通路對NPC CNE-1細胞遷移、侵襲及EMT的影響,以期揭示其作用機制,為臨床治療NPC的新藥開發(fā)研究提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株、試劑及儀器

人鼻咽癌CNE-1細胞株購自美國ATCC細胞庫;木犀草素(luteolin,LUT,貨號:491-70-3)購自Sigma-Aldrich公司;RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號:21870084)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,貨號:10099141C)均購自美國Gibco公司;MTT試劑盒(貨號:11465007001)購自美國Sigma公司;蛋白抽提試劑盒(貨號:P0028)、BCA蛋白定量試劑盒(貨號:P0010S)、PI3K通路抑制劑LY294002(貨號:S1737)購自上海碧云天公司;鼠源一抗anti-PI3K p85(貨號:MA5-32917)、anti-AKT(貨號:AHO1112)、anti-E-cadherin(貨號:33-4000)、anti-Vimentin(貨號:MA5-11883)、anti-GAPDH抗體(貨號:AM4300),兔源anti-p-PI3K p85(貨號:PA5-104853)、anti-p-AKT(貨號:MA5-14916)抗體,二抗羊抗鼠IgG(貨號:A-11001)、羊抗兔IgG(貨號:A-11008)均購自美國Invitrogen公司;鼠源一抗anti-MMP-2(貨號:ab86607)、anti-MMP-9(貨號:ab11906)購自英國Abcam公司;Evolution 220紫外分光光度計、FC酶標儀、Forma Steri-Cycle i160 5%CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 常規(guī)復蘇CNE-1細胞后,置于10% FBS、1%青鏈霉素RPMI-1640培養(yǎng)基中,于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞融合至80%-90%時進行傳代,用0.25%胰蛋白酶消化處理。

1.2.2 MTT檢測細胞存活 將對數(shù)期生長CNE-1細胞制備單細胞懸液,以細胞密度為3×104個/孔接種于96孔細胞板,分別添加LUT使其終濃度為20,40,60 μmol/ml,設為LUT低劑量組(LUT-L組)、中劑量組(LUT-M組)、高劑量組(LUT-H組),另設置在LUT低劑量基礎上添加PI3K通路抑制劑LY294002 1 μmol/ml為LY294002組,同時設正常培養(yǎng)CNE-1細胞為正常對照組(NC組),均培養(yǎng)48 h,每組6個復孔。培養(yǎng)結束后采用MTT試劑盒檢測各組CNE-1細胞存活率,具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。細胞存活率=(OD實驗組/ODNC組)×100%。

1.2.3 Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲 取對數(shù)期生長CNE-1細胞調(diào)整濃度為1×106個/孔接種于6孔細胞板,細胞分組同1.2.2。培養(yǎng)結束收集各組CNE-1細胞,調(diào)整濃度至1×105個/ml,取200 μl分別接種于鋪有或無matrigel膠的Transwell板小室中培養(yǎng)24 h后,90%乙醇固定,0.1%結晶紫常溫染色后,于倒置顯微鏡下觀察穿過膜的細胞數(shù),每張膜中央及周圍部分各隨機取5個視野,分別計算穿過聚碳酸酯膜微孔的細胞數(shù)。

1.2.4 免疫印跡(Western blot)檢測PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、MMP-2、MMP-9、E-cadherin和vimentin蛋白表達 提取各組CNE-1細胞總蛋白并采用BCA法測定蛋白濃度,具體操作參照蛋白提取試劑盒,蛋白樣品置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?0 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉,分別添加一抗anti-PI3K(1 ∶1 000)、anti-p-PI3K(1 ∶500)、anti-AKT(1 ∶500)、anti-p-AKT(1 ∶500)、anti-基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)(1 ∶500)、anti-MMP-9(1 ∶1 000)、anti-鈣黏蛋白(E-cadherin)(1 ∶500)、anti-波形蛋白(vimentin)(1 ∶200)、anti-GAPDH(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜,TBST緩沖液洗膜3次,添加二抗IgG(1 ∶5 000)室溫孵育1 h,洗膜,顯色,曝片,觀察并分析結果。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 LUT對鼻咽癌CNE-1細胞存活率的影響

與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組和LY294002組鼻咽癌CNE-1細胞存活率顯著降低(P<0.05),而LY294002組高于LUT-H組(P<0.05,見表1)。

表1 各組鼻咽癌CNE-1細胞存活率比較Table 1 Comparison of cell viability of nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

2.2 LUT對鼻咽癌CNE-1細胞遷移的影響

與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組和LY294002組鼻咽癌CNE-1細胞遷移細胞數(shù)顯著降低(P<0.05),而LY294002組高于LUT-H組(P<0.05,見圖1、表2)。

圖1 LUT對鼻咽癌CNE-1細胞遷移的影響Figure 1 Effect of LUT on migration of nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells

表2 各組鼻咽癌CNE-1細胞遷移和侵襲比較Table 2 Comparison of migratory cells of nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

2.3 LUT對鼻咽癌CNE-1細胞侵襲的影響

與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組、LY294002組鼻咽癌CNE-1細胞侵襲細胞數(shù)顯著降低(P<0.05),而LY294002組高于LUT-H組(P<0.05,見圖2、表2)。

圖2 LUT對鼻咽癌CNE-1細胞侵襲的影響Figure 2 Effect of LUT on invasion of nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells

2.4 LUT對鼻咽癌CNE-1細胞PI3K通路相關蛋白表達的影響

與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組和LY294002組鼻咽癌CNE-1細胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt顯著降低(P<0.05),而LY294002組高于LUT-H組(P<0.05,見圖3、表3)。

圖3 Western blot檢測鼻咽癌CNE-1細胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達Figure 3 Expression of p-PI3K, PI3K, p-Akt and Akt proteins in nasopharynx cancer CNE-1 cells detected by Western blot

表3 各組鼻咽癌CNE-1細胞中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比較Table 3 Comparison of p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt levels in nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

2.5 LUT對鼻咽癌CNE-1細胞遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組和LY294002組鼻咽癌CNE-1細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),而LY294002組高于LUT-H組(P<0.05,圖4、表4)。

圖4 WB檢測鼻咽癌CNE-1細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達Figure 4 Expression of MMP-2 and MMP-9 proteins in nasopharynx cancer CNE-1 cells detected by Western blot

表4 各組鼻咽癌CNE-1細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達水平比較Table 4 Comparison of MMP-2 and MMP-9 protein expression in nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

2.6 LUT對鼻咽癌CNE-1細胞EMT相關蛋白表達的影響

與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組和LY294002組鼻咽癌CNE-1細胞E-cadherin蛋白表達水平顯著增加(P<0.05),而LY294002組低于LUT-H組(P<0.05);vimentin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),而LY294002組高于LUT-H組(P<0.05,見圖5、表5)。

圖5 WB檢測鼻咽癌CNE-1細胞中E-cadherin、vimentin蛋白表達Figure 5 Expression of E-cadherin and vimentin proteins in nasopharynx cancer CNE-1 cells detected by Western blot

表5 各組鼻咽癌CNE-1細胞中E-cadherin、vimentin蛋白表達水平比較Table 5 Comparison of E-cadherin and vimentin protein expression in nasopharynx cancer CNE-1 cells among five

3 討論

近來,尋找安全、有效、副作用小的腫瘤化療替代藥物成為研究熱點之一。LUT是一種天然黃酮類化合物,多以糖苷形式存在于全葉青蘭、野菊花、金銀花、紫蘇等多種藥用植物中,具有鎮(zhèn)咳祛痰、消炎、抗過敏、抗病毒、抗腫瘤及抑制血管形成等多種作用[11,12]。Fan等[13]研究報道,黃酮類化合物LUT可通過抑制Src/Stat3/S100A7信號通路抑制鱗狀上皮細胞癌的遷移和侵襲。Yin等[14]研究報道,氰苷-3-O-葡萄糖苷與LUT協(xié)同抑制結腸癌和乳腺癌細胞的生長。本研究根據(jù)預實驗結果,設置LUT低、中、高濃度分別為20,40,60 μmol/L進行實驗研究,結果發(fā)現(xiàn),與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組和LUT-H組NCP CNE-1細胞存活率顯著降低,且呈劑量依賴性,提示LUT可抑制NCP CNE-1細胞增殖。

遷移、侵襲是腫瘤細胞區(qū)別于正常細胞的惡質(zhì)性特征,也是導致腫瘤復發(fā)、患者死亡的重要原因。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,本身具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶的活性,也具有磷脂酰肌醇激酶的活性,Akt是其主要下游效應分子,Akt活化是PI3K通路發(fā)揮作用的關鍵步驟,PI3K/Akt通路廣泛存在于多種腫瘤細胞中,與其增殖、遷移和侵襲密切相關。李仕晟等[15]研究報道,針對PI3K/Akt信號通路的NPC靶向治療可逆轉(zhuǎn)EB病毒膜潛伏蛋白1(Epstein-Barr virus membrane latent protein 1,LMP1)誘導的腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)抵抗作用,抑制PI3K/Akt信號通路可顯著提高CNE-1-LMP1細胞對TRAIL的敏感性。付銀鋒等[16]研究報道,LUT可抑制黑素瘤A375和B16F10細胞增殖、侵襲,誘導其凋亡,可能與抑制PI3K/Akt信號通路有關。鐘燁等[17]研究報道,LUT可通過PI3K/AKT信號通路下調(diào)甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞MMP2、MMP9蛋白表達,抑制侵襲和遷移能力。本研究結果發(fā)現(xiàn),與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組和LY294002組鼻咽癌CNE-1細胞遷移、侵襲細胞數(shù)、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著降低,而LY294002組均高于LUT-H組。MMPs可降解細胞外基質(zhì)中各種蛋白成分,破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障,促進其遷移、侵襲,以MMP-2、MMP-9蛋白研究居多,提示LUT可抑制NPC CNE-1細胞遷移、侵襲,可能與靶向抑制PI3K/Akt信號通路,下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達有關。

EMT是指上皮細胞到間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化,亦與細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力密切相關。其中細胞黏附分子E-cadherin蛋白表達缺失及間質(zhì)細胞標志蛋白vimentin蛋白表達上調(diào)是其重要特征,也是腫瘤形成的關鍵步驟[18,19]。Yu等[20]研究報道,磷酸酶1核靶向亞基(phosphatase 1 nuclear-targeting subunit,PNUTS)通過PI3K/AKT信號通路介導E-cadherin蛋白表達下調(diào)、vimentin蛋白表達上調(diào),促進電離輻射誘導的NPC CNE-2細胞遷移、侵襲和EMT。Chen等[21]研究報道,LUT通過干擾PI3K/Akt-NF-κB信號通路下調(diào)E-cadherin蛋白表達,減弱TGF-β1誘導的肺癌細胞EMT過程。本研究結果發(fā)現(xiàn),與NC組比較,LUT-L組、LUT-M組、LUT-H組和LY294002組鼻咽癌CNE-1細胞E-cadherin蛋白表達水平顯著增加,而LY294002組均低于LUT-H組;vimentin蛋白表達水平顯著降低,而LY294002組均高于LUT-H組。提示LUT可能通過PI3K/AKT信號通路介導NPC CNE-1細胞E-cadherin蛋白表達上調(diào)和vimentin蛋白表達下調(diào),抑制其EMT過程。

綜上所述,LUT可能通過靶向抑制PI3K通路抑制鼻咽癌CNE-1細胞遷移、侵襲,抑制其EMT過程,該發(fā)現(xiàn)可對LUT在NPC臨床治療應用提供一定理論依據(jù)。但本研究僅在細胞水平上證實LUT的抗NPC作用,存在不足,后期仍需進行動物實驗,探究其安全劑量,以待更加明確其作用機制。