張可可，崔正國(guó)，李悅悅，曲克明

(1 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

采用復(fù)合垂直流人工濕地系統(tǒng)，在探討海水養(yǎng)殖尾水中氮去除效果的基礎(chǔ)上，利用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，擬合了不同形態(tài)無(wú)機(jī)氮、有機(jī)氮的動(dòng)力學(xué)降解特征，并分析了海水人工濕地氮凈化效果與微生物群落組成、pH、溶氧、溫度等因素間的關(guān)系，以期為系統(tǒng)闡明海水人工濕地的除氮機(jī)理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

復(fù)合垂直流人工濕地具有下行流和上行流的復(fù)合水流方式，可實(shí)現(xiàn)較長(zhǎng)的水力停留時(shí)間(HRT)，使其硝化、反硝化能力顯著強(qiáng)于其他類型濕地。構(gòu)建了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的復(fù)合垂直流人工濕地水處理循環(huán)系統(tǒng)，循環(huán)系統(tǒng)包括人工濕地處理系統(tǒng)和養(yǎng)殖水回用系統(tǒng)兩大部分。人工濕地規(guī)格為60 cm × 40 cm × 70 cm，有效體積為60 L，由上、下行池構(gòu)成，進(jìn)水口處安裝布水管，以確保養(yǎng)殖尾水均勻進(jìn)入處理系統(tǒng)(圖1)。

下行池、上行池基質(zhì)的填充材料按照粒徑由大到小、自下而上分別為：粒徑3～5 cm的粗珊瑚石各20 cm，粒徑1～3 cm的細(xì)珊瑚石各20 cm，粒徑1～2 mm的細(xì)砂20 cm、15 cm。濕地植物選取耐鹽堿且根系發(fā)達(dá)的互花米草，種植密度為32株/m2。試驗(yàn)用水為牙鲆海水養(yǎng)殖尾水。

1.2 試驗(yàn)內(nèi)容及方法

1.2.1 運(yùn)行與采樣方法

人工濕地循環(huán)水處理系統(tǒng)釆用序批式進(jìn)水方式，水力停留時(shí)間約為9 min。將牙鲆養(yǎng)殖尾水通過(guò)水泵和布水管均勻注入人工濕地處理系統(tǒng)下行池，養(yǎng)殖尾水自下行池底部流入上行池，經(jīng)人工濕地處理系統(tǒng)后進(jìn)入儲(chǔ)水池，然后通過(guò)水泵再循環(huán)至濕地系統(tǒng)。正式試驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。其中無(wú)植物人工濕地處理系統(tǒng)運(yùn)行1個(gè)月，然后篩選生長(zhǎng)狀況良好的植株移植到系統(tǒng)中再運(yùn)行1個(gè)月。經(jīng)過(guò)2個(gè)月的試運(yùn)行，微生物群落形成，出水水質(zhì)基本達(dá)到穩(wěn)定。每天監(jiān)測(cè)系統(tǒng)進(jìn)出水指標(biāo)，2周后處理系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

溫度、溶氧(DO)、pH等理化參數(shù)及主要水質(zhì)指標(biāo)每2 d監(jiān)測(cè)一次，水樣過(guò)濾后置于-20 ℃冰箱內(nèi)冷凍儲(chǔ)存，用于測(cè)定DIN、DON和TDN的質(zhì)量濃度。完成氮降解動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)后，進(jìn)行微生物樣品采集。利用五點(diǎn)取樣法(圖2)分別采集不同基質(zhì)層和植物根部樣品進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。采樣后，將各層基質(zhì)和植物根部樣品分別混勻，基質(zhì)層樣品分別記為S1、S2、S3、S4、S5、S6，上行池和下行池植物根部分別記為G1和G2，共8個(gè)樣品分別放入無(wú)菌袋后置于-80 ℃冰箱保存。

圖2 復(fù)合垂直流人工濕地循環(huán)系統(tǒng)采樣示意圖

1.2.2 水質(zhì)分析

1.2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)PCR-DGGE分析

以樣品基因組DNA為模板，采用細(xì)菌引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)擴(kuò)增樣品16S rDNA高變區(qū)序列，其中，PCR儀為ABI GeneAmp? 9700型。

PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：5×FastPfu Buffer 4 μL；dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL；rTaq(5 U/μl)0.4 μL；Forward Primer(5 umol/L)0.8 μL；Reverse Primer(5 umol/L)0.8 μL；FastPfu Polymerase 0.4 μL；BSA 0.2 μL；Template DNA 10 ng；補(bǔ)ddH2O至20 μL。

PCR擴(kuò)增程序：第1階段，95 ℃ 預(yù)變性3 min；第2階段，95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s和72 ℃延伸45 s，循環(huán)27次；第3階段，72 ℃延伸7 min，后10 ℃保存。

1.3 結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型描述人工濕地中各形態(tài)氮的降解過(guò)程，計(jì)算公式如下[7]：

(1)

式中：c表示出水質(zhì)量濃度，mg/L；c0表示進(jìn)水質(zhì)量濃度，mg/L；c*表示背景質(zhì)量濃度，mg/L；T表示尾水凈化時(shí)間，h；Kv表示去除速率常數(shù)，h-1。

半衰期計(jì)算公式為：

T1/2=ln2/Kv

(2)

式中：T1/2表示半衰期，h；Kv表示去除速率常數(shù)，h-1。

微生物多樣性用Shannon指數(shù)表征[12]，其值越大說(shuō)明群落多樣性越高。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2018和Excel 2016處理。

2 結(jié)果

2.1 人工濕地系統(tǒng)內(nèi)各形態(tài)氮的去除效果

2.1.1 DIN、DON和TDN的去除效果

試驗(yàn)期間，系統(tǒng)內(nèi)水質(zhì)pH(7.34±0.37)，DO(7.00±0.33)mg/L，水溫(16.32±0.32)℃，鹽度(32.79±1.37)，各理化參數(shù)有利于系統(tǒng)內(nèi)脫氮過(guò)程的進(jìn)行。人工濕地系統(tǒng)出水口處TDN、DON、DIN質(zhì)量濃度和去除率如圖3a所示。從圖中可以看出，3種氮出水質(zhì)量濃度均呈下降趨勢(shì)，DIN的質(zhì)量濃度降低明顯，第5天質(zhì)量濃度為0.49 mg/L，出水質(zhì)量濃度符合SC/T 9103—2007《海水養(yǎng)殖水排放要求》一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[13](≤0.50 mg/L)，去除率為90.70%；TDN去除效果次之，去除率為72.65%；DON去除效果較差，去除率僅為44.53%。

DIN、DON占TDN質(zhì)量濃度比例如圖3b所示。DIN質(zhì)量濃度占比總體呈下降趨勢(shì)，第0天為60.13%，5 d后基本穩(wěn)定在20%左右；DON質(zhì)量濃度占比隨系統(tǒng)運(yùn)行呈升高趨勢(shì)，第5天達(dá)到79.76%。因而，DON較DIN難降解。

圖3 人工濕地系統(tǒng)DIN、DON、TDN去除效果和比例變化

圖4 人工濕地系統(tǒng)去除效果和比例變化

2.2 不同形態(tài)氮降解的動(dòng)力學(xué)特征

2.2.1 DIN、DON和TDN降解特征

人工濕地處理牙鲆養(yǎng)殖尾水過(guò)程中，DIN、DON、TDN的動(dòng)力學(xué)擬合曲線及參數(shù)如圖5a、表1所示。一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型能夠較好地描述人工濕地系統(tǒng)中DIN、DON、TDN的降解特征，其中，DIN、TDN的擬合程度最好，擬合度R2分別為0.98和0.99，DON稍差，R2為0.70。3種氮的去除速率常數(shù)和半衰期有所不同，DIN去除速率最快，去除速率常數(shù)和半衰期分別為0.10 h-1和7.24 h；TDN次之，分別為0.09 h-1和7.47h；DON最難降解，分別為0.03 h-1和27.18 h。

圖5 人工濕地系統(tǒng)內(nèi)DIN、DON、TDN和的降解擬合曲線

表1 氮的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.3 微生物多樣性分析

2.3.1 16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

從圖6可以看出，經(jīng)PCR擴(kuò)增后的8個(gè)樣品DNA均只含一條亮帶，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，且陰性對(duì)照未有產(chǎn)物出現(xiàn)，表明PCR擴(kuò)增效果良好，可用于DGGE分析。

圖6 PCR擴(kuò)增結(jié)果鑒定電泳圖

2.3.2 微生物群落多樣性

不同基質(zhì)層和植物根部樣品的微生物群落Shannon指數(shù)見(jiàn)圖7。人工濕地系統(tǒng)中不同基質(zhì)層間微生物群落的Shannon指數(shù)均在6以上，表明植物根部和基質(zhì)層間的微生物多樣性都較高。系統(tǒng)中上、下行池兩組取樣點(diǎn)微生物群落的Shannon指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，系統(tǒng)中植物根部微生物群落Shannon指數(shù)略低于基質(zhì)層。

圖7 各樣品的微生物群落Shannon指數(shù)

2.3.3 微生物群落組成

復(fù)合垂直流人工濕地系統(tǒng)在門水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)如圖8所示。人工濕地系統(tǒng)中基質(zhì)及植物根部微生物豐富度很高，這與系統(tǒng)具有較好的凈化效果符合。將豐度>1%的菌門作為主要菌門，共發(fā)現(xiàn)11個(gè)菌門，分別為變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、匿桿菌門(Latescibacteria)、厚壁菌門(Firmocutes)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)。其中，基質(zhì)和植物根部主要的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(31.52%～37.87%)、藍(lán)細(xì)菌門(8.34%～19.81%)、放線菌門(8.30%～14.07%)、綠彎菌門(8.72%～ 13.81%)和擬桿菌門(5.66%～10.46%)。

圖8 人工濕地系統(tǒng)內(nèi)微生物群落組成圖

3 討論

3.1 微生物群落對(duì)氮降解的影響分析

需要說(shuō)明的是，本試驗(yàn)獲得的動(dòng)力學(xué)參數(shù)只是在小試人工濕地系統(tǒng)中的模擬結(jié)果，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，還需進(jìn)行更大規(guī)模的中試試驗(yàn)和現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)的驗(yàn)證，以便使試驗(yàn)結(jié)果更加貼近實(shí)際應(yīng)用。

3.2 其他因素對(duì)氮降解的影響

4 結(jié)論

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