藍(lán)海恩，麥偉虹，黃煥昌，陳 釗，廖玲玲

（廣西畜牧研究所，廣西南寧530001）

抗生素的應(yīng)用對(duì)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；?、集約化發(fā)揮了巨大的促進(jìn)作用，但抗生素過(guò)度濫用導(dǎo)致的一系列負(fù)面問(wèn)題日益突出，“飼料禁抗”、“綠色飼料”已成為生態(tài)畜牧業(yè)健康發(fā)展的必然趨勢(shì)（鄧雪娟等，2019）。微生物發(fā)酵飼料是以微生物發(fā)酵為核心，在人工控制的條件下利用益生菌發(fā)酵，將植物性、動(dòng)物性以及礦物性飼料原料中的多糖、蛋白質(zhì)、纖維素等大分子物質(zhì)以及抗?fàn)I養(yǎng)因子進(jìn)行降解、分解和轉(zhuǎn)化，生成富含游離氨基酸、消化吸收酶、活性小肽、有機(jī)酸、促生長(zhǎng)因子等易于消化吸收的小分子物質(zhì)，形成有效益生菌含量高、營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好的飼料原料，其不僅可以提高飼料的利用率和營(yíng)養(yǎng)水平，降低養(yǎng)殖成本和提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，還可以調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡，促進(jìn)腸道健康，并且可以改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，具有積極的環(huán)保價(jià)值（王永偉等，2019；張碩等，2019；李天陽(yáng)等，2018）。當(dāng)前，人民消費(fèi)結(jié)構(gòu)調(diào)整、環(huán)保壓力、飼料原料價(jià)格上漲和禁抗歷史使命等諸多因素為微生物發(fā)酵飼料的發(fā)展提供了歷史機(jī)遇，低成本、高營(yíng)養(yǎng)、綠色環(huán)保的微生物發(fā)酵飼料有望成為飼料行業(yè)的新寵兒。目前，微生物發(fā)酵飼料在養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用尚處于起步階段，其在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的研究與應(yīng)用信息很有限，且研究主要集中在母豬和育肥豬方面（張錚等，2019；陸揚(yáng)等，2019），其在斷奶仔豬階段研究與應(yīng)用的報(bào)道相對(duì)較少，本試驗(yàn)以玉米、豆粕、麥麩為底物，利用復(fù)合益生菌制劑制備發(fā)酵飼料，探討復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能、腸道微生物菌群、血清生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的影響，評(píng)估發(fā)酵飼料在斷奶仔豬飼料中的應(yīng)用效果，為研發(fā)安全、高效、環(huán)保的適合斷奶仔豬應(yīng)用的發(fā)酵飼料提供參考，為發(fā)酵飼料在仔豬養(yǎng)殖生產(chǎn)中的開(kāi)發(fā)與推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 復(fù)合益生菌制劑 利用廣西畜牧研究所實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存的乳酸菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌分別制備菌液，將制備的乳酸菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液、酵母菌菌液以體積比2﹕1﹕1組成復(fù)合益生菌制劑，其活菌總數(shù)≥109cfu/g。

1.2 試劑盒 豬免疫球蛋白G（IgG）ELISA檢測(cè)試劑盒、豬免疫球蛋白A （IgA）ELISA檢測(cè)試劑盒、豬免疫球蛋白M（IgM）ELISA檢測(cè)試劑盒，豬補(bǔ)體 3（C3）ELISA檢測(cè)試劑盒、 豬補(bǔ)體 4（C4）ELISA檢測(cè)試劑盒、豬白介素-2（IL-2）ELISA檢測(cè)試劑盒、豬白介素-4（IL-4）ELISA檢測(cè)試劑盒、豬干擾素-γ（IFN-γ）ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.3 基礎(chǔ)日糧的制備 參照 《中國(guó)豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)2004》配制斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧，日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平如表1所示。

1.4 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料的制備 取基礎(chǔ)日糧中的飼料原料玉米、豆粕、麥麩為底物進(jìn)行發(fā)酵，將玉米、豆粕、麥麩按質(zhì)量比62﹕25﹕10混合均勻后，加入0.5%的復(fù)合益生菌制劑，邊攪拌邊加入，調(diào)節(jié)飼料濕度為40%，待混合均勻后置于單通閥的無(wú)菌發(fā)酵袋中，密封后室溫培養(yǎng)發(fā)酵5 d，發(fā)酵后的飼料具有濃烈的酸香味，此時(shí)烘干后即得發(fā)酵飼料原料。將獲得的發(fā)酵飼料原料（玉米、豆粕、麥麩）以10%比例替代基礎(chǔ)日糧中等量的飼料原料（玉米、豆粕、麥麩），配制含10%發(fā)酵飼料原料的復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料，日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平如表1所示。

1.5 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理 將80頭健康21日齡長(zhǎng)大二元雜交斷奶仔豬 （南寧傲農(nóng)育種技術(shù)有限公司隆安養(yǎng)殖場(chǎng)），隨機(jī)分成2組（對(duì)照組、試驗(yàn)組），每組40頭豬，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8頭豬，經(jīng)預(yù)試期6 d后，對(duì)照組仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組仔豬飼喂發(fā)酵飼料，試驗(yàn)期間所有重復(fù)中的日常飼養(yǎng)管理與疫苗免疫接種均完全一致，按時(shí)進(jìn)行消毒與衛(wèi)生清掃，試驗(yàn)仔豬均自由采食與飲水，試驗(yàn)期為35 d。

1.6 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.6.1 生長(zhǎng)性能的測(cè)定 分別在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)和結(jié)束時(shí)對(duì)每頭試驗(yàn)仔豬進(jìn)行空腹稱重，根據(jù)初始重和末重計(jì)算試驗(yàn)期內(nèi)每頭試驗(yàn)仔豬的日均增重。分別記錄每重復(fù)中8頭豬的每日飼料消耗量，計(jì)算試驗(yàn)期內(nèi)每頭試驗(yàn)仔豬的日均采食量。根據(jù)日均采食量和日均增重計(jì)算料重比。觀察每頭試驗(yàn)仔豬每日是否有腹瀉情況，根據(jù)各處理組試驗(yàn)仔豬在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)的腹瀉發(fā)病數(shù)和腹瀉天數(shù)計(jì)算腹瀉率。

腹瀉率/%=（腹瀉頭數(shù)×腹瀉天數(shù)）/（試驗(yàn)頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù)）。

1.6.2 腸道微生物菌群的測(cè)定 在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)從每重復(fù)的8頭試驗(yàn)豬中隨機(jī)抓取2頭進(jìn)行屠宰，在無(wú)菌條件下分別采集所有屠宰豬的同一部位盲腸、結(jié)腸、直腸各1 g，將其分別加入含9 mL滅菌生理鹽水的試管中，搗碎混合均勻后，分別接種EMB瓊脂平板、BS瓊脂平板、LBS瓊脂平板，進(jìn)行大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌的分離培養(yǎng)。根據(jù)平板中的菌落數(shù)量計(jì)算腸道中微生物菌群數(shù)量，并用1 g腸道中細(xì)菌數(shù)的對(duì)數(shù)lg（cfu/g）表示。

1.6.3 血清生化指標(biāo)的測(cè)定 在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)每頭試驗(yàn)仔豬分別采集血液1.0 mL，常規(guī)方法分離血清樣品。利用全自動(dòng)生化分析儀依次對(duì)血清樣品中的總蛋白、白蛋白、尿素氮、堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量等血清生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.6.4 血清免疫指標(biāo)的測(cè)定 利用ELISA檢測(cè)試劑盒依次對(duì)血清樣品中的免疫球蛋白含量、補(bǔ)體含量、細(xì)胞因子含量等血清免疫指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，具體參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)性能的測(cè)定結(jié)果 如表2所示，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比較，日均采食量提高0.66%（P＜0.05），日均增重提高 1.19%（P ＜ 0.05），料重比降低 0.77%（P＞0.05）， 腹瀉率降低 57.22%（P＜0.05）。該結(jié)果表明復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料能夠顯著提高斷奶仔豬的采食量和增重，降低斷奶仔豬的腹瀉發(fā)生率，提高仔豬生長(zhǎng)性能。

表2 生長(zhǎng)性能的測(cè)定結(jié)果

2.2 腸道微生物菌群的測(cè)定結(jié)果 如表3所示，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比較，盲腸、結(jié)腸、直腸中的大腸桿菌數(shù)分別降低 2.39%（P＜0.05）、2.01%（P＜0.05）、1.64%（P ＜ 0.05），盲腸、結(jié)腸、直腸中的雙歧桿菌數(shù)分別提高 1.20%（P＜0.05）、1.34%（P＜0.05）、1.20%（P ＜ 0.05），盲腸、結(jié)腸、直腸中的乳酸桿菌數(shù)分別提高 2.14%（P＜0.05）、1.66%（P＜0.05）、2.05%（P ＜ 0.05）。 該結(jié)果表明復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料能夠顯著改善斷奶仔豬的腸道微生物菌群微生態(tài)平衡，保障腸道健康，提高腸道功能。

2.3 血清生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果 如表4所示，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比較，總蛋白含量提高7.44%（P＜ 0.05），白蛋白含量提高 7.61%（P ＜ 0.05），尿素氮含量降低0.97%（P＞0.05），堿性磷酸酶含量降低 5.75%（P＜0.05），谷草轉(zhuǎn)氨酶含量降低了0.98%（P＞0.05）。該結(jié)果表明復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料能夠顯著提高斷奶仔豬血清中的總蛋白含量和白蛋白含量，降低堿性磷酸酶含量，改善血清生化指標(biāo)。

表4 血清生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

2.4 血清免疫指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果 如表5所示，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比較，在免疫球蛋白含量方面，IgG、IgA、IgM 含量分別提高 18.90%（P ＜ 0.05）、9.89%（P ＜ 0.05）、1.19%（P ＞ 0.05）； 在補(bǔ)體含量方面，C3和C4含量分別提高1.79%（P＞0.05）和4.83%（P ＜ 0.05）；在細(xì)胞因子含量方面，IL-2、IL-4、IFN-γ 含量分別提高 7.15%（P ＜ 0.05）、5.03%（P＜0.05）、1.19%（P ＞0.05）。 該結(jié)果表明復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料能夠顯著提高斷奶仔豬血清中的免疫球蛋白含量、補(bǔ)體含量和細(xì)胞因子含量，改善血清免疫指標(biāo)，提高仔豬的免疫功能。

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響 由于仔豬在斷奶時(shí)自身的消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，且仔豬在斷奶前后容易受到飲食、生活環(huán)境改變的應(yīng)激，極易造成仔豬生長(zhǎng)發(fā)育受阻、腹瀉，導(dǎo)致仔豬生長(zhǎng)緩慢，影響仔豬的生長(zhǎng)性能。飼料發(fā)酵過(guò)程是飼料原料和益生菌互相作用的過(guò)程，飼料原料可以為益生菌生長(zhǎng)繁殖提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，益生菌生長(zhǎng)繁殖后可產(chǎn)生大量的菌體蛋白、維生素、各種酶的代謝產(chǎn)物、有機(jī)酸等，而在相互作用的過(guò)程中飼料原料被益生菌降解、分解、轉(zhuǎn)化為游離氨基酸、可溶性多肽、單糖、促生長(zhǎng)因子等小分子物質(zhì)（阮棟等，2019）。對(duì)于消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完全的仔豬，這相當(dāng)于生物發(fā)酵對(duì)飼料原料做了前期處理，使飼料更容易消化吸收，且適口性好，富含益生菌代謝產(chǎn)物，有利于腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高飼料轉(zhuǎn)化利用率和營(yíng)養(yǎng)水平，增加仔豬采食量和日增重，提高仔豬生長(zhǎng)性能，降低腹瀉率，進(jìn)而降低養(yǎng)殖成本，增加養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。

表3 腸道微生物菌群的測(cè)定結(jié)果lg cfu/g

表5 血清免疫指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

3.2 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)仔豬腸道微生物菌群的影響 正常情況下動(dòng)物腸道內(nèi)的微生物菌群保持著一種微生態(tài)平衡，腸道微生物菌群的這種平衡在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、維系宿主健康中起著關(guān)鍵作用（朱原等，2019）。益生菌為一種活性微生態(tài)制劑，主要包括乳酸菌類、芽孢桿菌類和酵母菌類，其中芽孢桿菌能夠通過(guò)分泌細(xì)胞外酶來(lái)降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，乳酸菌能夠產(chǎn)生有機(jī)酸并降低底物的pH，酵母菌能夠?qū)⒛c桿菌結(jié)合到其表面并且能夠阻斷大腸桿菌與腸上皮的結(jié)合（陳婷等，2019）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料能夠顯著提高斷奶仔豬腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌數(shù)量，降低大腸桿菌等有害菌數(shù)量，有益菌群數(shù)量的增加和有害菌群數(shù)量的下降，優(yōu)化了仔豬腸道內(nèi)的微生物菌群平衡，提高了仔豬腸道健康水平，與本試驗(yàn)中提高生長(zhǎng)性能和降低腹瀉率的檢測(cè)結(jié)果體現(xiàn)出了一致性。同時(shí)，本研究試驗(yàn)結(jié)果與Price等（2010）的研究結(jié)果相一致，其研究表明，飼喂微生物發(fā)酵飼料能夠顯著提高仔豬腸道微生物菌群中的Bacteroides屬菌群比例。

3.3 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)仔豬血清生化指標(biāo)的影響 當(dāng)動(dòng)物機(jī)體受到應(yīng)激后，各組織器官會(huì)發(fā)生系列應(yīng)對(duì)與改善措施，導(dǎo)致血液中各指標(biāo)發(fā)生變化，因而血清生化指標(biāo)可在一定程度上反映出動(dòng)物機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)代謝情況以及各組織器官的功能情況 （楊紅萍等，2017）。在諸多血清生化指標(biāo)中，總蛋白和白蛋白含量反映了血液中蛋白質(zhì)的吸收和利用情況，血清中總蛋白和白蛋白含量越高表示氨基酸越容易分解，蛋白質(zhì)越容易沉積，動(dòng)物機(jī)體越健康；堿性磷酸酶是肝臟、膽囊等組織的代謝產(chǎn)物，當(dāng)肝臟、膽囊等組織受到損傷或發(fā)生病變時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量堿性磷酸酶并釋放到血液中，使血清中堿性磷酸酶含量升高，故血清中堿性磷酸酶含量越低表示肝臟、膽囊等組織越健康。在本研究中，飼喂復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料仔豬血清中的總蛋白和白蛋白含量均顯著提高，而堿性磷酸酶含量顯著降低，其在一定程度上表明復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料能夠調(diào)節(jié)氨基酸和蛋白質(zhì)之間的平衡，能夠有效促進(jìn)蛋白質(zhì)的吸收和沉積，且能夠保護(hù)動(dòng)物肝臟、膽囊等組織器官免受損傷，改善肝臟、膽囊等組織器官功能，提高動(dòng)物機(jī)體健康。

3.4 復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料對(duì)仔豬血清免疫指標(biāo)的影響 血清免疫指標(biāo)的檢測(cè)有效避免了過(guò)去檢測(cè)脾臟、胸腺等免疫器官指數(shù)所需要的屠宰、解剖等復(fù)雜操作，且更滿足動(dòng)物福利的保障要求，其將逐步成為動(dòng)物免疫功能研究的新指標(biāo)。在血清免疫指標(biāo)中，免疫球蛋白直接參與動(dòng)物機(jī)體的體液免疫反應(yīng)，其含量變化與動(dòng)物機(jī)體免疫力密切相關(guān)（張效榮等，2014）；補(bǔ)體為一種血清蛋白質(zhì)，是介導(dǎo)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的主要媒介（黃河玉等，2016）；細(xì)胞因子為一類在細(xì)胞間傳遞信息的蛋白質(zhì)或小分子多肽，其在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)和效應(yīng)中起著重要作用 （高玲美等，2003）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料能夠顯著提高斷奶仔豬血清中的免疫球蛋白、補(bǔ)體和細(xì)胞因子含量，改善血清免疫指標(biāo)，提高仔豬的免疫功能，為動(dòng)物機(jī)體免疫功能的檢測(cè)提供了新方法，為復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料在仔豬生產(chǎn)中的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料可顯著改善斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能、腸道微生物菌群、血清生化指標(biāo)、血清免疫指標(biāo)，提高斷奶仔豬健康水平，增加養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。