馬 興， 宋 旭， 肖亞兵

（天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津300461）

飼料中氰化物主要來(lái)源于植物源性飼草、飼料本身所含有的氰甙類物質(zhì)，目前已知的氰甙類物質(zhì)達(dá)21種（雷祖玉等，1992），種類雖少，但廣泛分布于各類植物中。幾乎所有的植物中都會(huì)含有痕量氰，部分植物中含量甚至高達(dá)500 mg/kg。常用作飼草、飼料或飼料原料的木薯 （Banea等，2012）、燕麥幼苗、玉米幼苗、高粱幼苗、海南刀豆（李瓊芳等，2006）和亞麻籽（張建華等，1998）等含氰量都比較高。當(dāng)氰甙進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，在酸和酶的作用下會(huì)釋放出游離氰化物，由于氰離子具有很強(qiáng)的金屬配位能力，能夠抑制細(xì)胞內(nèi)多種含金屬離子的酶系統(tǒng)，致使細(xì)胞色素氧化酶、乳酸脫氫酶和過(guò)氧化氫酶等失活，從而導(dǎo)致中毒現(xiàn)象（Kumar等，2019；Kumar等，2018； 翟雙雙等，2014）。輕度氰化物中毒表現(xiàn)為精神萎靡、食欲不佳、體弱消瘦，嚴(yán)重者多由于窒息、肌肉痙攣導(dǎo)致死亡。

目前，測(cè)定飼料中氰化物含量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 13084-2006規(guī)定了氫氰酸與苦味酸鈉的定性顯色方法和分光光度的定量檢測(cè)方法。其中定量檢測(cè)方法操作要點(diǎn)是樣品粉碎浸泡后用水蒸氣蒸餾的方法將氫氰酸蒸出，用氫氧化鈉溶液吸收，然后與異煙酸-吡唑啉酮反應(yīng)顯色，分光光度計(jì)測(cè)定。但是傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾時(shí)間長(zhǎng)，操作復(fù)雜，重現(xiàn)性較差，后續(xù)分光光度法步驟也較為繁瑣，不可控因素較多，需耗費(fèi)大量人力。這些缺點(diǎn)也導(dǎo)致該方法檢測(cè)效率較低，易出現(xiàn)偶然誤差，對(duì)檢測(cè)人員的操作技能和檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)要求較高。

流動(dòng)注射分析儀目前主要應(yīng)用于水質(zhì)氰化物、揮發(fā)酚等的檢測(cè)。與傳統(tǒng)分光光度法相比，流動(dòng)注射分析法具有自動(dòng)化高、進(jìn)樣量小、試劑消耗量小、環(huán)保性高、檢測(cè)量大、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。目前飼料樣品中氰化物含量的測(cè)定主要還是應(yīng)用分光光度法（高月等，2016；周小潔等，2008），流動(dòng)注射法鮮有報(bào)道。近年來(lái)，流動(dòng)注射法在食品、海水和白酒等復(fù)雜基體中硫酸鹽 （Ruiz-Capillas等,2009）、痕量錳（Feng 等，2018）、氰化物（閔巍等，2018）等項(xiàng)目的檢測(cè)中均取得了較好的結(jié)果。

本文使用課題組自主設(shè)計(jì)并制備的快速水蒸氣蒸餾儀提取飼料中氰化物，再用流動(dòng)注射儀檢測(cè)，將檢測(cè)流程由原先的5～7 h縮短至30 min以內(nèi)，節(jié)省了人力物力，提高了檢測(cè)效率，方法檢出限、準(zhǔn)確度和精密度均滿足實(shí)際要求。

1 材料與方法

1.1 儀器試劑

1.1.1 儀器 連續(xù)流動(dòng)注射儀：德國(guó)Seal公司Seal Auto Analyzer 3型；自動(dòng)進(jìn)樣器：德國(guó)Seal公司XY-2型；超純水系統(tǒng)：美國(guó)密理博公司Milli-Q型；分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司ME203型，感量0.001 g；快速水蒸氣蒸餾儀：自主研發(fā)。

1.1.2 試劑 氫氧化鈉、鹽酸、乙酸、異煙酸、檸檬酸、硫酸鋅、酚酞、二甲基巴比妥酸、鄰苯二甲酸氫鉀、酒石酸、乙酸鋅、吡唑酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯胺T：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW（E）080115：50.0 μg/mL，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。 氰化物標(biāo)準(zhǔn)中間液：1.0 μg/mL，吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用2 g/L氫氧化鈉溶液定容至50 mL。流動(dòng)注射儀所需試劑按照Seal公司自帶方法配制；分光光度法所需試劑按照GB/T 13084-2006要求配制。

1.2 流動(dòng)注射儀工作條件 進(jìn)樣速率30個(gè)/h；進(jìn)樣清洗比（時(shí)間）3：1；蒸餾溫度 135 ℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 樣品前處理 將飼料樣品粉碎或勻漿，迅速稱取10 g（精確到0.001 g）待測(cè)樣品置于500 mL反應(yīng)瓶中，加入200 mL去離子水，迅速安裝至快速水蒸氣蒸餾儀中，并將冷凝管下端插入盛有5 mL濃度為10 g/mL氫氧化鈉溶液的三角瓶中，室溫放置10 min。向反應(yīng)瓶中加入20 mL濃度為100 g/L的乙酸鋅溶液和1～2 g酒石酸后，迅速將反應(yīng)瓶安裝于快速水蒸氣蒸餾儀中，設(shè)定接收液質(zhì)量達(dá)到90 g為蒸餾終點(diǎn)，并啟動(dòng)加熱程序。蒸餾結(jié)束后，將接收液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，并定容。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制 分別吸取 0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 mL 氰化物標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL具塞比色管，用2 g/mL氫氧化鈉溶液定容，所配制的氰化物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度分別為 0、0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500 μg/mL。分別取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液5 mL，用流動(dòng)注射儀進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液為橫坐標(biāo)，以峰高為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇及優(yōu)化

2.1.1 快速水蒸氣蒸餾前樣品浸泡時(shí)間的選擇飼料樣品中氰化物并不穩(wěn)定，粉碎或勻漿后需要及時(shí)提取。采用快速水蒸氣蒸餾前，樣品需室溫中浸泡一段時(shí)間使氰甙水解。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選取飼料用木薯粉、含木薯成分豬飼料和玉米苗青貯作為目標(biāo)樣品，考察了浸泡時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。如表1所示，對(duì)于三種不同類型飼料，浸泡時(shí)間分別為 10、30 min，1、2 h，所得檢測(cè)結(jié)果均在 10%誤差范圍內(nèi)，并無(wú)顯著性差別，為提高實(shí)驗(yàn)效率，故選擇浸泡時(shí)間為10 min。

2.1.2 水蒸氣蒸餾速度的選擇 快速水蒸氣蒸餾儀可根據(jù)實(shí)際需求選擇蒸氣量，蒸氣量的大小直接決定蒸餾時(shí)間的長(zhǎng)短。試驗(yàn)過(guò)程中，選取飼料用木薯粉、含木薯成分豬飼料和玉米苗青貯作為目標(biāo)樣品，在浸泡時(shí)間均為10 min的條件下，分別選擇高、中、低三種不同大小蒸氣量對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行氰化物提取，所得結(jié)果無(wú)顯著性差異，故選擇較高蒸氣量開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)，樣品提取時(shí)間約8～10 min，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 不同浸泡時(shí)間下提取氰化物檢測(cè)結(jié)果mg/kg

2.2 線性方程及方法檢出限 用連續(xù)流動(dòng)注射儀對(duì)1.3.2中所述氰化物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL），以峰高為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行線性擬合，得線性方程Y=498609X+6443.7，線性相關(guān)系數(shù)為0.9997。對(duì)空白溶液進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，以測(cè)定值3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法檢出限，得方法檢出限為0.0023 mg/L。當(dāng)稱樣量為10 g，定容體積為100 mL時(shí)，待測(cè)樣品中氰化物的檢測(cè)限為0.023 mg/kg（以氰離子計(jì)）。

表2 不同蒸氣量下提取氰化物檢測(cè)結(jié)果mg/kg

2.3 精密度測(cè)試 以飼料用木薯粉、含木薯成分豬飼料和玉米苗青貯作為目標(biāo)樣品，每個(gè)樣品按照前述方法全流程重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算結(jié)果的精密度，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，3個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%～4.9%，表明本方法精密度較好。

2.4 加標(biāo)回收測(cè)試 以飼料用木薯粉、含木薯成分豬飼料和玉米苗青貯為本底，分別加入高、中、低三種不同濃度的氰化物標(biāo)準(zhǔn)中間液，每個(gè)樣品按照前述方法全流程重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算每個(gè)樣品的平均加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4數(shù)據(jù)可以看出，三個(gè)不同濃度的樣品平均加標(biāo)回收率為96.5%～104%，表明本方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 本方法與國(guó)標(biāo)方法結(jié)果比對(duì) 用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 13084-2006檢測(cè)方法分別對(duì)飼料用木薯粉、含木薯成分豬飼料和玉米苗青貯進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果與本文方法進(jìn)行比對(duì)，并計(jì)算相對(duì)偏差，結(jié)果見(jiàn)表5。從表5可以看出，兩種方法測(cè)定結(jié)果的偏差為3.7%～6.3%，符合GB/T 13084-2006的規(guī)定。

表4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了快速水蒸氣蒸餾-流動(dòng)注射分析儀聯(lián)用測(cè)定飼料中氰化物含量的檢測(cè)方法。快速水蒸氣蒸餾儀的使用，能夠有效提高前處理效率；流動(dòng)注射分析儀的使用，簡(jiǎn)化了檢測(cè)中的人工操作，提高了檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，本方法檢出限、定量限、精密度和準(zhǔn)確度均能夠滿足實(shí)際檢測(cè)需求；采用本方法和國(guó)標(biāo)方法測(cè)定三種不同飼料樣品中氰化物的含量，所得結(jié)果數(shù)據(jù)無(wú)顯著性差異。本方法與國(guó)標(biāo)方法相比，全流程檢測(cè)時(shí)間僅為國(guó)標(biāo)方法的1/10，同時(shí)具有準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，在分析大批量飼料樣品時(shí)具有較大優(yōu)勢(shì)。

表5 與國(guó)標(biāo)方法比對(duì)