左春生， 徐光科， 焦鳳超， 李迎曉， 吳海港， 何 敏， 黃 立， 趙 聘

（信陽農林學院/河南省水禽資源開發(fā)利用與疫病防控工程技術研究中心，河南信陽464000）

鴨疫里默氏菌（RA）可感染鴨、鵝、火雞等多種禽類，病原體可引起以漿膜炎為特征的敗血性疾病，又稱鴨傳染性漿膜炎，可導致高死亡率和顯著性經濟損失（Jiakai Sundd 等，2019）。

隨著各類抗生素和化學合成藥物的普遍使用，越來越多的鴨疫里默氏菌耐藥菌株產生，并且藥物殘留問題給畜牧業(yè)和人類健康帶來了巨大的危害。2013—2018年分離的137株耐藥菌中，共檢測到162個耐藥菌株的高頻突變位點，分析結果顯示，只在GyrA發(fā)生Ser83Ile突變的菌株MIC值增加了8～16倍，所有突變菌株均對氨芐西林、孢噻呋、喹諾酮 、氨基糖甙耐藥 （Zhu等，2019；朱元軍等，2019）。

植物精油是一種綠色、安全的植物源性藥物，具有抗菌、增強免疫力、提高應激及改善生產性能的優(yōu)點，是目前新型飼料添加劑研發(fā)的重點和熱點之一。其作為抗生素的替代品運用到畜禽生產上具有很大的潛力。隨著國內外學者的不斷研究，植物精油的應用也在日益加深，其在醫(yī)學方面、植物保護、食品行業(yè)以及日化產品中扮演著越來越重要的角色（劉濤等，2009；丁玉軍等，2009；張萬里等，2009；李有志等，2007；杜傳來等，2004）。 本文以探討五種植物精油對鴨疫里默氏菌的體外抑菌效果為研究目的，為防治鴨疫里默氏菌病天然藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗藥品 桉葉油，桉葉素≥70.0%；紫蘇油相，紫蘇醛≥25.0%；陳皮油，檸檬烯≥86.0%；薄荷油，總醇量（以薄荷醇計）≥79.0；肉桂油，肉桂荃≥71%（四川恒瑞通達提供）。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基 RA血清1型標準菌株由上海獸醫(yī)研究所胡青海博士惠贈。質控菌株大腸桿菌ATCC25922購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。TSA瓊脂培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基購自杭州天和微生物試劑有限公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.3 試驗儀器 Tu1810分光光度計、20334008電子天平，上海精密科學儀器有限公司；LHP-400恒溫培養(yǎng)箱、LB-111B恒溫培養(yǎng)搖床，常州潤華電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的復蘇與鑒定 將保存的菌株稀釋后劃線接種于TSA平板，置于燭缸中37℃培養(yǎng)36 h，挑取可疑菌落轉接種TSA培養(yǎng)基（含5%胎牛血清）純培養(yǎng)后，革蘭氏染色和瑞氏染色后檢查細菌形態(tài)。挑取TSA培養(yǎng)基純化后的單菌落轉接種TSB培養(yǎng)基（含5%胎牛血清）增菌培養(yǎng)后待用。

1.2.2 接種培養(yǎng) 挑取一接種環(huán)平板菌分別接入5 mL相應的液體肉湯培養(yǎng)基中，置恒溫振蕩器（轉速為200 r/min）37℃振蕩培養(yǎng)24 h后，以2%的接種量分別接種到100 mL 37℃預熱的TSA中，搖勻后，分裝于12支試管中置氣浴恒溫振蕩器，37℃振蕩培養(yǎng)，此一時間設為0。然后在不同時間間隔內（表1），任取一管液體培養(yǎng)物以無菌生理鹽水連續(xù)作10倍稀釋，采用平板表面涂布計數(shù)法，進行活菌計數(shù)。

按各試管號的時間取菌液，取稀釋的后三個稀釋度，準確吸取50 μL均勻涂布到滅菌后的固體培養(yǎng)基上，每個時間點做三個平行瓊脂平板，在37℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)18～24 h，然后計數(shù)（一般菌落數(shù)在30～300個為宜，50個左右最好）。

1.2.3 細菌計數(shù) 細菌計數(shù)按農業(yè)農村部頒發(fā)的獸醫(yī)生物制品規(guī)程進行。即分別將TSB培養(yǎng)物進行 10、102、103、104、105倍稀釋， 然后取 0.1 mL 的稀釋液接種TSA平板，每個稀釋度做兩個平板，置蠟燭罐中，37℃培養(yǎng)24 h，進行菌落計數(shù)，兩個平板上菌落的平均數(shù)即為該稀釋度的細菌數(shù)，再按稀釋度計算每毫升菌液的細菌含量。

1.2.4 生長曲線測定 以每毫升cfu log10對數(shù)值為縱坐標，生長時間為橫坐標，分別繪制三種培養(yǎng)基增菌的生長曲線。

1.2.5 菌懸液的制備 用滅菌水將對數(shù)生長期菌落洗下制成菌懸液,再用生理鹽水把制備好的菌懸液以10倍比稀釋，使菌液的濃度為105～106cfu/mL。放在4℃冰箱保存或立即接種培養(yǎng)（蔡紅等，2013；郎利敏，2011）。

1.2.6 精油藥敏片的制備 每瓶放100個6 mm大小的濾紙片，分別加入300 μL桉葉油、紫蘇油、陳皮油、薄荷葉油，對照組加入等量生理鹽水，浸泡30 min。無菌條件下，分別將浸有不同植物精油的藥敏片貼到涂布有菌懸液的TSA培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24 h，每種精油設置2個平行試驗。

1.2.7 最小抑菌濃度的測定 精油配制：取50 μL不同的植物精油用70%乙醇定容到5 mL，即將其稀釋成1%（V/V）的精油原液。用蒸餾水將以上的精油原液采用倍比稀釋法稀釋到0.0625%備用。測定方法：以桉葉油為例，取裝有2.5 mL TSB培養(yǎng)基的試管12個并依次標號，向1號試管加入2.5 mL上述配制的精油原液，充分吹吸均勻，再從第一管中吸取2.5 mL液體加到2號試管中，重復上述步驟，吹吸均勻后吸取2.5 mL于3號試管中，第10號試管的液體棄去；然后向1到10號試管里各加入100 μL的菌懸液，11號試管只加精油不加菌懸液，12號試管不加精油只加菌懸液，作為對照組。置于燭缸中37℃培養(yǎng)24 h，分光光度計600 mm可見光測量各管的濁度，測定精油對鴨疫里默氏菌的最小抑菌濃度（MIC）。

2 結果與分析

2.1 鴨疫里默氏菌生長情況 鴨疫里默氏菌培養(yǎng)計數(shù)試驗數(shù)據(jù)分析如表1和圖1所示。

2.2 每種植物精油對鴨疫里默氏菌的敏感性將貼過藥敏片的培養(yǎng)基于燭缸中37℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈的大小，然后再用游標卡尺測定每個抑菌圈的直徑，重復三次，計算每種精油抑菌圈的平均值。抑菌圈直徑小于10 mm為耐藥；10～15 mm為低度敏感；16～20 mm為中度敏感；20 mm以上為高度敏感。試驗結果見表2。

表2 精油敏感性判定

2.3 精油對鴨疫里默氏菌的最小抑菌濃度測定由表3可知，桉葉油、肉桂油、陳皮油、紫蘇油、薄荷油分別在第 4、3、4、3、2 管 OD 值急速增大，MIC 分 別 為 78.12、156.24、78.12、156.24、312.5 μL/L。綜合評定五種精油對鴨疫里默氏菌的抑菌效果分別是桉葉油＞肉桂油＞陳皮油＞紫蘇油＞薄荷油。

3 討論與結論

試驗過程中由于精油原液顏色不同與肉湯混合后會有不同程度的渾濁；不同稀釋度精油混合肉湯產生輕微乳濁樣，對試驗結果的觀察造成困擾。采用紫外分光光度計測定每個管的濁度，取得各管培養(yǎng)前后OD的變化值可減小試驗誤差。

研究表明，肉桂醛對大腸桿菌、沙門氏菌 、黃色葡萄球菌、鏈球菌具有較強的抑菌效果 （袁瑤等，2019；王康莉等，2019）

陳林林（2010）發(fā)現(xiàn)，柑橘皮精油對大腸桿菌、白色葡萄球菌和青霉均有較強的抑菌作用，對大腸桿菌的抑菌作用最強；紫蘇葉油化學成分的研究表明其主要成分為紫蘇醛，還有少量的檸檬烯及少量α一蒎烯等。張子揚等（1990）對紫蘇葉油進行的抑菌性試驗結果表明，紫蘇葉揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的MIC值為500 μg/mL；王紅星等（1996）發(fā)現(xiàn)，桉葉油的主要成分沒食子酸有明顯的抑菌效果；周露等（2011）研究了薄荷精油對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、煙曲白色念珠菌的抗菌活性，結果顯示薄荷精油對大腸桿菌、金霉菌、白色念珠菌有明顯的抗菌活性。

關于精油對鴨疫里默氏菌體外抑菌試驗，國內鮮見報道。另外精油提取原料選材、提取工藝、有效成分、抑菌機理或對鴨疫里默氏菌病的治療效果尚需進一步深入研究。

表3 桉葉油對鴨疫里默氏菌的抑菌性測定數(shù)據(jù)