鄧凱偉，童翠紅

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院，河南信陽(yáng)464000）

DNA甲基化為DNA化學(xué)修飾中的一種形式，能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。也就是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。甲基化基因Tet（Tet1、Tet2、Tet3）家族蛋白能將 5-甲基胞嘧啶（5-mC）氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC），從而促進(jìn) DNA的主動(dòng)去甲基化。Tet1在小鼠的胚胎干細(xì)胞中表達(dá)量很高，并已經(jīng)被證明參與小鼠胚胎干細(xì)胞的維持（范安然，2013；Gu 等 2011）；Tet2 可以導(dǎo)致相關(guān)組蛋白修飾的改變以調(diào)控基因表達(dá)，與機(jī)體正常造血調(diào)控密切相關(guān)；Tet3在MII期卵母細(xì)胞表達(dá)量會(huì)顯著上升且主要參與受精過(guò)程中父本基因組的重編程，當(dāng)敲除雌性小鼠卵母細(xì)胞Tet3時(shí)，其生育能力下降。HT-2毒素影響基因的表觀修飾進(jìn)而引起生殖障礙等（Hsu等1972），會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)內(nèi)分泌發(fā)生變化等癥狀（Wu等，2010）。研究表明，DNA甲基化狀態(tài)在卵母細(xì)胞中尤為重要，它對(duì)卵母細(xì)胞中基因的調(diào)控和胚胎中特定基因的激活具有促進(jìn)作用（Bird等，1985）。

本試驗(yàn)旨在闡明該毒素對(duì)小鼠MII期卵母細(xì)胞甲基化基因、DNA甲基化及卵巢質(zhì)量的影響，對(duì)小鼠卵巢重量及HT-2毒素對(duì)小鼠MII期卵母細(xì)胞生殖毒性引起Tet1、Tet2、Tet3甲基化基因及DNA甲基化的變化進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 HT-2毒素 （批號(hào)LPA0S118CAS：26934-87-2），二甲基亞砜（DM-SO）（批號(hào) SHBJ7919），磷酸鹽緩沖液（PBS）（批號(hào) PB2004Y）， 透明質(zhì)酸酶 （批號(hào) 19877177），TCM-199（批號(hào) TBD11150），多聚甲醛，聚乙烯吡咯烷酮 （PVP）（批號(hào) P0930-50G），TritonX-100（批號(hào)T8200），均購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；絨毛膜促性腺激素（HCG）（批號(hào) 180117），孕馬血清促性腺激素（PMSG）（批號(hào) S170714），均購(gòu)自寧波市三生藥業(yè)有限公司；RNA-Be-Locker A試劑（批號(hào)E613KA8733），購(gòu)自上海Sangon生物技術(shù)公司；白蛋白（批號(hào)630G055），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；山羊抗兔568IgG，山羊抗小鼠488IgG，5-mC 抗 體 （ 批 號(hào) 21818005），5-hmC（10617005），均購(gòu)自艾搏抗（上海）貿(mào)易有限公司；RNase-Free DNase Set試劑盒，購(gòu)自 QIANEN公司；RNA提取液（批號(hào)G3013），購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司；未說(shuō)明試劑均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 主要設(shè)備 電熱鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)CS101-1E），電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)BTL-50A），均購(gòu)自重慶萬(wàn)達(dá)儀器有限公司；潔凈工作臺(tái)（型號(hào)SW-CJ-1D），購(gòu)自廣州瑞智凈化設(shè)備有限公司；體式顯微鏡，購(gòu)自上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī) （型號(hào) KDC-140HR）， 熒光顯微鏡（Nikon C1Plus），熒光定量 PCR 儀（Stepone plus），均購(gòu)自塞維爾（谷歌）生物科技有限公司。

1.1.3 試劑的配制 孕馬血清促性腺激素（PMSG）：將1000 IU的PMSG溶于超純水中配成100 IU/mL的溶液，然后放于-20℃保存。

絨毛膜促性腺激素 （HCG）：將1000 IU的HCG溶于生理鹽水中配成100 IU/mL的溶液，然后放于-20℃保存。

HT-2毒素：將HT-2毒素（10 mg）溶于22.75 mL的DMSO中，配成0.3 mg/mL的HT-2毒素濃儲(chǔ)液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物與管理 將體重為19～21 g，4～5周齡清潔級(jí)昆明雌性小鼠24只（信陽(yáng)市衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院），隨機(jī)分為4組，每組6只。自由飲水和采食，進(jìn)行灌胃16 d。

1.2.2 小鼠的超排 灌胃第17天對(duì)小鼠腹腔注射10 IU的PMSG，48 h后對(duì)小鼠腹腔注射15 IU的HCG，16 h后采集試驗(yàn)動(dòng)物MII期卵母細(xì)胞。

1.2.3 小鼠MII期卵母細(xì)胞的采集及處理 小鼠脫臼處死，取出卵巢進(jìn)行稱重記錄。

將取出的輸卵管置于37℃的PBS緩沖液中，在體式顯微鏡下，于輸卵管壺腹部取出卵團(tuán)，置于含0.03%透明質(zhì)酸酶的M2培養(yǎng)液消化顆粒細(xì)胞，收集MII期卵母細(xì)胞。用37℃的PBS緩沖液清洗3次，最后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管（100枚/管），每組3個(gè)重復(fù)，置于-80℃的干冰中凍存。

1.2.4 激光共聚焦 將MII期卵母細(xì)胞用37℃的PBS液體清洗3次，用4%的多聚甲醛在室溫下固定15 min，再用0.1%的PVP清洗3次。用0.2%的TritonX-100在室溫下停留30 min，再移入4 mol/L的鹽酸中停留15 min。于37℃的PBS液體清洗3次，移入1%BSA放置4℃的冰箱封閉過(guò)夜。12 h后，小鼠單抗、兔單抗各加10 μL，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中固定2 h。用0.1%的PVP清洗3次，再加入二抗（山羊抗小鼠488、山羊抗兔568）各 10 μL，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中固定 1 h，再用37℃的PBS液體清洗3次，每次停留5 min。載玻片上每個(gè)液滴里放入2～4枚卵母細(xì)胞，加入熒光萃取劑，蓋上蓋玻片進(jìn)行封片。

用Image-Pro Plus 6.0軟件將綠色/紅色熒光單色照片轉(zhuǎn)換為黑白圖片，然后選取相同的黑色作為判斷所有照片陽(yáng)性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽(yáng)性的累積光密度值（IOD）以及組織的像素面積（AREA）。并求出平均光密度值（AO值），AO=IOD/AREA，AO值越大表明陽(yáng)性表達(dá)水平越高。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量分析

1.2.5.1 基因引物序列 根據(jù)GenBank上登錄的小鼠Tet1、Tet2及Tet3基因序列，應(yīng)用Oligo7.0和Primer6軟件設(shè)計(jì)引物，引物由武漢塞維爾生物科技有限公司合成。引物相關(guān)信息見(jiàn)表1。

1.2.5.2 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 采用QIAGEN試劑盒提取總RNA，按照試劑盒中的操作步驟說(shuō)明進(jìn)行小鼠卵母細(xì)胞總RNA提取。

取2 μg總RNA放置于PCR管中，加入1 μLOligo（dT），加去離子水直至 12 μL。 放于 PCR 儀上65℃保溫10 min，快速置于冰上冷卻。然后依次加入 4 μL 5× Reaction Buffer，2 μL 10 mmoL dNTP Mix，1 moL RiboLock RNAase抑制劑和 1 moL RevertAi M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，用移液槍充分混勻。放于PCR儀上42℃保溫60 min，最后在70℃水浴中保溫5 min。

表1 熒光定量PCR檢測(cè)基因引物序列

1.2.5.3 熒光定量PCR擴(kuò)增 取0.2 mL PCR管，配制反應(yīng)體系如表2，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。PCR擴(kuò)增過(guò)程如表3。

表2 配制反應(yīng)體系所需反應(yīng)物及體積

表3 PCR擴(kuò)增過(guò)程

1.2.6 結(jié)果處理

ΔΔCT法：

A=CT（目的基因，待測(cè)樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本）；

B=CT（目的基因，對(duì)照樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本）；

K=A-B；

表達(dá)倍數(shù)=2-K。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 21.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HT-2毒素對(duì)小鼠卵巢重量的影響 由表4可知，2 mg/kg HT-2毒素組的卵巢重量較對(duì)照組極顯著降低 （P ＜ 0.01）；2 mg/kg組較 1、1.5 mg/kg組顯著降低（P＜0.05）；其他各組間差異不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明HT-2毒素會(huì)極顯著降低小鼠卵巢重量，濃度為2 mg/kg時(shí)為其發(fā)揮作用的較適濃度。

表4 HT-2毒素對(duì)小鼠卵巢重量的影響g

2.2 HT-2毒素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞甲基化基因表達(dá)的影響 由表5可知，Tet1、Tet2基因表達(dá)水平試驗(yàn)組和對(duì)照組無(wú)顯著差異 （P＞0.05）；2 mg/kg組Tet3基因表達(dá)水平較對(duì)照組極顯著降低 （P＜0.01）；2 mg/kg組較 1 mg/kg和 1.5 mg/kg組顯著降低（P ＜ 0.05）；其他各組差異不顯著（P ＞ 0.05）。表明HT-2毒素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞中Tet1和Tet2基因的表達(dá)無(wú)顯著性影響（P＞0.05），而使Tet3基因表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01）。

表5 HT-2毒素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞甲基化基因表達(dá)的影響

2.3 HT-2毒素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞甲基化的影響由表6可知，HT-2毒素處理后，5-mC和5-hmC的AO值總體均為上升的趨勢(shì)。5-mC的AO值中，1.5、2 mg/kg組較對(duì)照組和1 mg/kg兩組極顯著提高（P＜0.01）；1.5 mg/kg組與 2 mg/kg組差異極顯著（P＜0.01）；其他組別間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。 5-hmC 的 AO 值中，1.5、2 mg/kg組較對(duì)照組和1 mg/kg組極顯著提高（P＜0.01）。各梯度中5-mC和5-hmC平均光密度值間差異均極顯著（P＜0.01）。說(shuō)明HT-2毒素會(huì)導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞甲基化總體水平的上升。

表6 HT-2毒素對(duì)激光共聚焦平均光密度值（AO值）的影響

3 討論

3.1 霉菌毒素對(duì)動(dòng)物生殖性能的影響 霉菌毒素能使動(dòng)物體的生殖性能發(fā)生障礙。利用已被嘔吐毒素污染的飼料對(duì)豬進(jìn)行飼喂，發(fā)現(xiàn)該毒素可以直接干擾減數(shù)分裂時(shí)的微管動(dòng)力學(xué)以及豬卵母細(xì)胞的成熟，進(jìn)而降低豬的生殖性能（Schoevers等，2010）。 吳彩霞等（2007）研究表明，HT-2 毒素也會(huì)降低豬及家禽的繁殖性能和改變機(jī)體器官的相對(duì)重量。有研究表明，HT-2毒素具有穿透血腦屏障的能力，可以通過(guò)胎盤到達(dá)胎兒 （Wang等2014），從而導(dǎo)致流產(chǎn)，死胎等。有研究報(bào)道羊和?？诜⒘康腍T-2毒素后，卵巢功能發(fā)生變化，卵巢顆粒細(xì)胞活力顯著降低，激素的分泌受到影響（Huszenicza等，2000）。 本試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組小鼠在梯度2 mg/kg毒素下，卵巢重量極大地降低（P＜0.01）。這表明該種毒素可能通過(guò)影響卵巢的質(zhì)量及其功能進(jìn)而降低動(dòng)物機(jī)體的繁殖性能。

3.2 霉菌毒素對(duì)甲基化基因的影響 李曉紅等（2018）研究表明，幾種真菌毒素即使在作用機(jī)理不盡相同的情況下，都可以增加DNA甲基化水平。朱程程（2016）研究表明，混合毒素和HT-2毒素等都會(huì)影響DNA甲基化水平，且HT-2毒素會(huì)提高DNA甲基化水平。已有研究表明，DNA甲基化水平對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的生殖作用具有重要的調(diào)節(jié)作用，且Tet基因家族中的Tet3基因表達(dá)水平的波動(dòng)會(huì)影響雌性小鼠的生育能力。因此通過(guò)檢測(cè)Tet3基因的表達(dá)水平及細(xì)胞DNA甲基化的情況，可以一定程度上從分子水平反映該毒素對(duì)小鼠MII期卵母細(xì)胞的生殖毒性。

RT-PCR結(jié)果表明，2 mg/kg HT-2毒素組小鼠卵母細(xì)胞相關(guān)調(diào)控DNA去甲基化的Tet家族基因中Tet3基因的表達(dá)極顯著降低 （P＜0.01）；免疫熒光激光共聚焦結(jié)果表明，HT-2毒素會(huì)極顯著提高小鼠卵母細(xì)胞DNA甲基化水平 （P＜0.01）。HT-2毒素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞生殖毒性的影響及具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，HT-2毒素均會(huì)使小鼠卵巢比重降低，這可能是該毒素降低動(dòng)物體生殖性能的原因之一。另外，從RT-PCR和激光共聚焦熒光檢測(cè)結(jié)果可知，HT-2毒素可通過(guò)影響Tet家族基因中Tet3基因表達(dá)水平進(jìn)而影響小鼠卵母細(xì)胞DNA甲基化水平。