王陽 藍海燕 王鎮(zhèn)波 陳剛 吳旭庭 黃仲堅

【摘要】 目的 探討腦梗塞大鼠病理模型神經(jīng)干細胞的變化及中藥的影響。方法 購置Wistar大鼠90只， 隨機取20只作為空白對照組;70只建立腦梗塞大鼠病理模型， 建模成功后隨機分為模型對照組（40只）和低、中、高劑量中藥組（各10只）?？瞻讓φ战M、模型對照組術(shù)后35、40、45、50、55、60 d分批處死大鼠， 免疫組織化學法檢測5-溴脫氧尿苷（Brdu）+標記陽性細胞， 確定海馬區(qū)BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數(shù)量。空白對照組、模型對照組均常規(guī)喂養(yǎng)， 低、中、高劑量中藥組用補陽還五湯干預(yù)， 60 d后對各組效果進行評估比較。結(jié)果 模型對照組術(shù)后35、40、45、50、55、60 d海馬區(qū)BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數(shù)量均高于空白對照組， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;模型對照組隨著檢測時間的延長神經(jīng)干細胞數(shù)量呈下降趨勢， 不同時間點比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。高劑量中藥組海馬區(qū)BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數(shù)量分別為（38.47±3.10）、（19.32±1.59）、（7.14±1.43）、（7.97±1.31）、（4.02±1.01）， 中劑量中藥組分別為（43.45±3.23）、（21.85±0.67）、（8.64±1.67）、（8.21±1.26）、（4.75±1.14）， 低劑量中藥組分別為（38.43±3.16）、（19.36±0.61）、（7.13±0.89）、（7.95±1.13）、（4.00±0.99）， 模型對照組分別為（13.79±3.29）、（5.49±1.11）、（2.79±1.43）、（3.16±0.78）、（1.82±0.12）， 空白對照組分別為（7.71±2.31）、（3.25±0.59）、（2.42±0.42）、（1.12±0.23）、（0.92±0.11）;高、中、低劑量中藥組海馬區(qū)BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數(shù)量明顯高于模型對照組和空白對照組， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;中劑量中藥組海馬區(qū)BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數(shù)量增加明顯。結(jié)論 腦梗塞大鼠病理模型的建立能激活神經(jīng)干細胞活性， 使神經(jīng)干細胞增殖分化， 補陽還五湯能促進神經(jīng)干細胞增殖分化， 使神經(jīng)功能恢復(fù)， 以中劑量藥物更利于神經(jīng)再生。

【關(guān)鍵詞】 補陽還五湯;腦梗塞病理模型;神經(jīng)干細胞;電脈沖刺激

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.21.091

腦梗塞是由于腦部血液供應(yīng)障礙、缺氧或缺血引起的局限性腦組織缺血性壞死或軟化。臨床上， 將腦梗塞分為腦血栓形成、腔隙性梗死和腦栓塞等， 占全部腦卒中的80%[1]。臨床研究表明， 腦梗塞與糖尿病、高血壓、心律失常等疾病有關(guān)， 臨床多表現(xiàn)為猝然昏倒、半身不遂、言語障礙等， 影響患者的健康、生活。目前， 對于腦梗塞的治療臨床上采用中藥及針灸方法一直是傳統(tǒng)醫(yī)學的優(yōu)勢與特點。補陽還五湯是中醫(yī)代表性處方， 且該方的研究從藥理作用、配方規(guī)律及物質(zhì)基礎(chǔ)均具有大量研究。但是， 國內(nèi)外研究更多的集中在腦卒中的急性期腦缺血性損傷， 給藥時間較短， 導(dǎo)致理論與臨床存在一定差距[2]。近年來， 隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展， 神經(jīng)干細胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病成為嶄新的領(lǐng)域， 但是其具體機制尚未闡明。因此， 本研究以Wistar大鼠作為研究對象， 探討腦梗塞大鼠病理模型神經(jīng)干細胞的變化及中藥的影響， 報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 2018年8月～2019年5月購置于醫(yī)科大學實驗動物房Wistar大鼠90只， 雄性， 體重230～

280 g， 完成大鼠的常規(guī)喂養(yǎng)、光照。隨機取20只作為空白對照組;70只建立腦梗塞大鼠病理模型， 建模成功后隨機分為模型對照組（40只）和低、中、高劑量中藥組（各10只）。

1. 2 儀器與設(shè)備 4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司）、蘇木素-伊紅（HE）染色（北京索萊寶科技有限公司）、PBS緩沖液（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、酶標儀（美國賽默飛世爾科公司）、組織切片機（德國Leica公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus）等。

1. 3 方法

1. 3. 1 動物模型建立 對大鼠用10%水合氯醛完成腹腔麻醉， 用立體定位儀固定大鼠， 在右眼與右耳連線上做長為1.5 cm的切口， 鈍性分離顳肌， 充分暴露顳骨。在倒置顯微鏡下予牙科鉆在鱗狀骨與顴骨交界處向嘴側(cè)1 mm所對的鱗骨上鉆直徑為2 mm的小孔;用11號手術(shù)刀切開硬膜， 充分暴露大腦中動脈（MCA）并予電凝阻斷， 顳肌復(fù)位， 縫合傷口， 模擬腦梗塞。術(shù)后24 h用“大鼠隨機電脈沖刺激儀”（自制， 模擬勞則耗氣、驚則氣亂發(fā)病因素， 加重損傷刺激， 使大鼠肢體偏癱癥狀延遲恢復(fù)， 未刺激手術(shù)大鼠由于其特殊腦血管分布， 側(cè)支循環(huán)建立， 一般1周內(nèi)偏癱癥狀恢復(fù)）連續(xù)刺激15 d， 刺激方式：平均每30分鐘刺激1次， 持續(xù)1 min/次， 頻率0.5 Hz， 電壓5～60 V逐漸調(diào)高。以行為變化（神經(jīng)功能缺失）評分、外在表現(xiàn)、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、肌電變化、經(jīng)顱多譜勒（TCD）檢查和腦組織病理學改變， 血及腦組織能量代謝， 微循環(huán)及血液流變學變化為主要模型判定指標[3]。

1. 3. 2 干預(yù)方法 空白對照組、模型對照組均常規(guī)喂養(yǎng)。低、中、高劑量中藥組用補陽還五湯干預(yù)。補陽還五湯：生黃芪120 g、當歸尾6 g、地龍3 g、赤芍4.5 g、紅花3 g、川芎3 g、桃仁3 g， 經(jīng)高溫蒸餾水配制成補陽還五湯。低劑量組藥物濃度5 g/kg， 中劑量組藥物濃度7.5 g/kg， 高劑量組藥物濃度10 g/kg， 灌胃2次/d， 60 d后對各組效果進行評估。

1. 4 觀察指標

1. 4. 1 空白對照組與模型對照組神經(jīng)干細胞變化 空白對照組（10只）、模型對照組各時間點（術(shù)后35、40、45、50、55、60 d）（5只）以斷頸處死大鼠， 處死前均注射Brdu， 免疫組織化學法檢測Brdu+標記陽性細胞， 確定標記海馬區(qū)BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數(shù)量， 并對空白對照組與模型對照組神經(jīng)干細胞變化進行比較。

1. 4. 2 高、中、低劑量中藥組及模型對照組、空白對照組神經(jīng)干細胞變化? ?取高、中、低劑量中藥組大鼠10只， 以斷頸方式處死， 完成神經(jīng)干細胞數(shù)量的測定。對高、中、低劑量中藥組及模型對照組、空白對照組神經(jīng)干細胞變化進行比較。

1. 5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 空白對照組與模型對照組神經(jīng)干細胞變化比較

模型對照組術(shù)后35、40、45、50、55、60 d海馬區(qū)BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數(shù)量均高于空白對照組， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;模型對照組隨著檢測時間的延長神經(jīng)干細胞數(shù)量呈下降趨勢， 不同時間點比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 高、中、低劑量中藥組及模型對照組、空白對照組神經(jīng)干細胞變化比較 高劑量中藥組海馬區(qū)BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數(shù)量分別為（38.47±3.10）、（19.32±1.59）、（7.14±1.43）、（7.97±1.31）、（4.02±1.01）， 中劑量中藥組分別為（43.45±3.23）、（21.85±0.67）、（8.64±1.67）、（8.21±1.26）、（4.75±1.14）， 低劑量中藥組分別為（38.43±3.16）、（19.36±0.61）、（7.13±0.89）、（7.95±1.13）、（4.00±0.99）， 模型對照組分別為（13.79±3.29）、（5.49±1.11）、（2.79±1.43）、（3.16±0.78）、（1.82±0.12）， 空白對照組分別為（7.71±2.31）、（3.25±0.59）、（2.42±0.42）、（1.12±0.23）、（0.92±0.11）;高、中、低劑量中藥組海馬區(qū)BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數(shù)量明顯高于模型對照組和空白對照組， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;中劑量中藥組海馬區(qū)BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數(shù)量增加明顯。見表2。

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在不斷更新、分化潛能的神經(jīng)干細胞已經(jīng)成為共識， 但是腦梗塞對細胞數(shù)量及結(jié)構(gòu)的影響研究較少。本研究中以大鼠作為對象， 建立腦梗塞大鼠病理模型， 分析其對神經(jīng)細胞的影響。臨床研究表明：Brdu能標記具有增殖活性的細胞， 而卵蛋白是神經(jīng)前體細胞或神經(jīng)細胞的特征性生物學標記。為了避免其他因素對腦內(nèi)細胞的增殖， 本研究中給予Brdu+/Nsetin+雙標陽性細胞確定增殖的神經(jīng)細胞， 結(jié)果顯示：模型對照組術(shù)后35、40、45、50、55、60 d海馬區(qū)BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數(shù)量均高于空白對照組， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;模型對照組隨著檢測時間的延長神經(jīng)干細胞數(shù)量呈下降趨勢， 不同時間點比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明腦梗塞大鼠病理模型的建立能激活神經(jīng)干細胞活性， 可直接參與疾病的發(fā)生、發(fā)展， 可能與激活的神經(jīng)細胞遷移、進一步分化有關(guān)。中醫(yī)是腦梗塞常用的治療干預(yù)方法， 能充分發(fā)揮中醫(yī)辨證施治的效果。本研究中， 以補陽還五湯對大鼠進行干預(yù)， 方藥由生黃芪、當歸尾、地龍、赤芍、紅花、川芎、桃仁組成。方藥中生黃芪具有利尿消腫、補氣、止汗功效;當歸尾多用于經(jīng)閉不通、瘀血積滯;地龍具有通絡(luò)、平喘、利尿功效;赤芍具有清熱涼血、活血祛瘀功效;紅花具有活血通經(jīng)、散瘀止痛功效;川芎具有活血祛瘀、行氣開郁、祛風止痛功效;桃仁具有活血祛瘀、止咳平喘功效;諸藥共奏， 能發(fā)揮補氣、活血、通絡(luò)功效[4]。補陽還五湯用于腦梗塞大鼠中能減輕其腦部損傷， 利于大鼠恢復(fù)。本研究中， 高、中、低劑量中藥組海馬區(qū)BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數(shù)量明顯高于模型對照組和空白對照組， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;中劑量中藥組海馬區(qū)BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數(shù)量增加明顯。說明中劑量補陽還五湯干預(yù)更能提高神經(jīng)干細胞活性。

綜上所述， 腦梗塞大鼠病理模型的建立能激活神經(jīng)干細胞活性， 使神經(jīng)干細胞增殖分化;補陽還五湯能促進神經(jīng)干細胞增殖分化， 使神經(jīng)功能恢復(fù)， 以中劑量藥物更利于神經(jīng)再生。

參考文獻

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[2] 李振， 程丹丹， 陳偉， 等. 褪黑素對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)干細胞增殖的影響及機制研究. 中華神經(jīng)科雜志， 2018， 51（12）：977-984.

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[收稿日期：2020-03-23]