鄧小娟，敖素華

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院門診部，成都 610072；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肺病科，瀘州 646000)

肺癌在我國具有高發(fā)病率和高死亡率等特點(diǎn)，這一大難題長期困擾著臨床醫(yī)生。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌主要的類型，約占80%[1]。目前臨床上常用治療方法包括手術(shù)、放化療等，但其療效多數(shù)仍不盡人意，臨床治療失敗的主要原因?yàn)槟[瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。由于惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多因素、多途徑、多環(huán)節(jié)等過程，目前臨床上使用的單靶點(diǎn)藥物常常不能達(dá)到令人滿意的效果。中藥是藥用化合物的天然寶庫，同時(shí)也是發(fā)現(xiàn)新型活性化合物的重要途徑。許多報(bào)道證實(shí)，某些中藥成分具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡、激活自噬的活性[2-4]。蘆根常用于治肺熱咳嗽、肺癰吐膿、大葉性肺炎等[5-8]。調(diào)查顯示，許多經(jīng)典名方中均加入以蘆根為原料的中藥治療肺癌，可顯著抑制肺癌發(fā)展并改善肺功能[9-13]。其中，蘆根多糖具有多方面藥理活性，如提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等[14]。這些研究均提示蘆根多糖可能具有顯著的抗肺癌作用。然而，蘆根多糖是否對NSCLC具有顯著的抑制作用，有待深入研究。因此，本課題以前期研究為基礎(chǔ)，通過體外及體內(nèi)模型，開展蘆根多糖對NSCLC抑制的作用及機(jī)制研究，為中藥蘆根抗肺癌活性的開發(fā)應(yīng)用奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 A549細(xì)胞：NSCLC細(xì)胞系，來源于CCTCC武漢細(xì)胞庫。本實(shí)驗(yàn)室長期傳代保存，采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2及相對濕度95%條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.2動物 Balb/c裸鼠：無特定病原體(SPF)級，4～6周齡，雄鼠，體質(zhì)量16～20 g。購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2013-24。飼養(yǎng)間溫度：25～26 ℃，飼養(yǎng)間濕度：55%～70%，12 h明暗交替，常規(guī)全價(jià)繁殖期飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.1.3藥物與試劑 蘆根(四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，批號：180528)；蘆根多糖：由實(shí)驗(yàn)室前期制備分離，提取率為1.64%，本實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存。順鉑(Cis-platinum，DDP)，每瓶0.02 g，批號：1WA2A1311031B。RPIM 1640培養(yǎng)基(Gibco，批號：1848026)；CCK-8細(xì)胞活力試劑盒(Dojindo，批號：GB707)；AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C3062M)；磷酸鹽緩沖溶液-PBS粉末(索萊寶生物科技有限公司，批號：P1010)；二甲亞砜(Dimethyl suphoxide，DMSO，Sigma公司，批號：SHBH7843)；Caspase-3抗體(美國abcam生物科技公司，批號：ab69482)；PI 3 Kinase p110α Goat mAb(Cell Signal Technology，批號：4249)；Phospho-PI 3 Kinase p85(Tyr458)/p55(Tyr199)Antibody(Cell Signal Technology，批號：4228)；Akt Rabbit mAb(Cell Signal Technology，批號：4603)；Phospho-Akt(Ser473)Rabbit mAb(Cell Signal Technology，批號：4080)；Bcl-2(D 55G 8)Goat mAb(Cell Signal Technology，批號：4223)；β-Actin(13E 5)Goat mAb(Cell Signal Technology，100 μL，批號：4970)；Anti-Rabbit IgG(Cell Signal Technology，批號：4414)。

1.1.4主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，USA，型號：LS-C 0150)；潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：SW-CJ-2FD)；多模式微孔檢測儀(美國Bio-Tek，USA，型號：Cytation3)；倒置相差熒光顯微鏡(日本Nikon，型號：TS 100)；電子天平(美國OHAUS，型號：AR 2140，感量：0.01 mg)；流式細(xì)胞儀(美國BD生物科技公司，型號：FACSVerse)；移液器(德國Eppendorf系列，2.5～1000 μL)；高速離心機(jī)(廣州科栢實(shí)驗(yàn)器材有限公司，型號：lwicrfuge16)。

1.2方法

1.2.1工作液配制 蘆根多糖工作液：取40 mg蘆根多糖，加入1 mL PBS中配制濃度為40 mg·mL-1，臨用前用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至4，2，1，0.5，0.25 mg·mL-1，備用。順鉑工作液配制：取1瓶順鉑，每次給藥前取100 μL加2400 μL生理鹽水至2.5 mL。順鉑溶液配制在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，配制后密封備用。

1.2.2小鼠A549肺癌移植瘤模型建立 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，胰蛋白酶消化及培養(yǎng)基終止消化后離心，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)·mL-1。將細(xì)胞懸液接種于裸鼠右側(cè)腋下，每只接種0.1 mL，7 d后瘤體形成，建立NSCLC A549移植瘤模型。A549細(xì)胞接種到裸鼠身上13 d后，若小鼠瘤體體積達(dá)到90 mm3，則表明A549裸鼠移植瘤模型成功。

1.2.3蘆根多糖對A549細(xì)胞及在體肺癌移植瘤的抑制作用 將移植瘤模型小鼠隨機(jī)分為3組，即順鉑組(2 mg·kg-1，每2天腹腔注射1次，9次)，蘆根多糖組(100 mg·kg-1，每天灌胃1次，連續(xù)給藥18 d)和對照組(與蘆根多糖組等體積的配制的蘆根多糖溶劑，每天灌胃1次，連續(xù)給藥18 d)。

密切觀察小鼠造模前后及給藥前后的精神狀態(tài)、飲食、體質(zhì)量變化及死亡情況。分別于首次給藥后第3，6，9，12，15，18天測量腫瘤體積(V=1/2ab2，a表示腫瘤最長半徑，b表示腫瘤最短半徑)，繪制腫瘤瘤體生長曲線圖。末次給藥后24 h處死，解剖取瘤，記錄瘤體質(zhì)量，剝?nèi)∧[瘤組織，并將其固定于10%甲醛溶液中，且剪取部分腫瘤組織凍存于液氮中。

計(jì)算腫瘤抑制率：腫瘤抑制率(%)=(對照組腫瘤體積-藥物組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%。

1.2.4CCK-8檢測細(xì)胞活性 蘆根多糖處理A549細(xì)胞48 h后，將處于對數(shù)生長期細(xì)胞接種在96孔板中，濃度調(diào)整為5×104個(gè)·mL-1，加細(xì)胞懸液每孔100 μL，細(xì)胞貼壁后，每孔加CCK-8 10 μL，孵育2 h，450 nm處測吸光度值(A)。根據(jù)A值計(jì)算抑制率，抑制率(%)=(對照組A-藥物組A)/對照組A×100%。

1.2.5流式檢測細(xì)胞凋亡 藥物干預(yù)：以細(xì)胞密度為每孔4×105個(gè)接種于6孔板，每孔900 μL，設(shè)置蘆根多糖組、空白對照組，每組三個(gè)復(fù)孔。48 h后，蘆根多糖組加入蘆根多糖工作液(100 mg·mL-1，100 μL)，空白對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL。

流式檢測細(xì)胞凋亡：48 h后取出6孔板，棄去全部上清液，使用PBS液，清洗細(xì)胞2次。胰酶消化、離心、PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)·mL-1。按照Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說明書要求，取細(xì)胞懸液100 μL于EP管中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，用槍頭輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。隨后，將EP管中的全部液體轉(zhuǎn)移至流式檢測管中，再加入400 μL PBS，混勻，上機(jī)檢測。流式細(xì)胞結(jié)果按照不同象限區(qū)分，Q 1區(qū)：PI(+)AnnexinV(-)，代表機(jī)械性死亡細(xì)胞區(qū)；Q2區(qū)：PI(+)AnnexinV(+)，代表晚期凋亡細(xì)胞區(qū)；Q3區(qū)：PI(-)AnnexinV(+)，代表早期凋亡區(qū)；Q4區(qū)：PI(-)AnnexinV(-)，代表活細(xì)胞區(qū)。

1.2.6Western blotting檢測LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ，PI3K，p-PI3K，AKT及p-AKT蛋白表達(dá)水平 將細(xì)胞以密度為每孔4×105個(gè)接種于6孔板中，加入蘆根多糖工作液(100 mg·mL-1，100 μL)，孵育48 h后，提取蛋白，測含量。跑膠、電泳1.5 h、轉(zhuǎn)膜 2.5 h、封閉1.5 h。一抗 4 ℃過夜，二抗孵育 2 h，顯色，凝膠圖像分析軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.2.7免疫組化法檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá) 腫瘤組織在10%甲醛溶液中固定12 h后，常規(guī)石蠟包埋切片，3%H2O2清除內(nèi)源性過氧化酶，并進(jìn)行熱修復(fù)抗原；加入一抗(Bax，1：100；Bcl-2，1：250；Caspase-3，1：25稀釋)，37 ℃ 孵育；加入HRP標(biāo)記的二抗孵育；DAB 顯色，蘇木精復(fù)染；鏡檢。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPASS 21.0版統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用 LSD 法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同濃度蘆根多糖對A549細(xì)胞活性的影響 根據(jù)抗腫瘤藥物非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則，抑制率大于30%認(rèn)為藥物對腫瘤細(xì)胞較為敏感。將不同濃度蘆根多糖分別干預(yù)A549細(xì)胞24，48及72 h后，使用CCK-8試劑盒對細(xì)胞活力進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆根多糖在濃度100 μg·mL-1，干預(yù)48及72 h時(shí)，對A549細(xì)胞的增殖抑制率最佳，大于30%(P<0.05)，見圖1。

①與對照組比較，P<0.05。

2.2蘆根多糖顯著促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡 為進(jìn)一步探討蘆根多糖對A549細(xì)胞增殖活性的抑制效應(yīng)是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)。利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測蘆根多糖干預(yù)后的A549細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，蘆根多糖組早期凋亡(Annexin-V+/PI-，Q3象限)和晚期凋亡(Annexin-V+/PI+，Q2象限)細(xì)胞的比例明顯升高(P<0.05)，見圖2。提示蘆根多糖具有促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡的作用。

2.3蘆根多糖促進(jìn)A549細(xì)胞自噬 為進(jìn)一步探討蘆根多糖抑制A549細(xì)胞增殖是否亦與激活細(xì)胞自噬有關(guān)，利用western blot對自噬激活關(guān)鍵蛋白LC3以及自噬經(jīng)典信號通路PI3K-AKT相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測。LC3蛋白是一種自噬標(biāo)記物，自噬激活后LC3-Ⅰ會通過酶解一小段多肽轉(zhuǎn)變成LC 3-Ⅱ，因此LC 3-Ⅱ/Ⅰ比例增加提示自噬激活[15]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，蘆根多糖組LC 3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯升高(P<0.01)，表明A549細(xì)胞自噬被激活；盡管與對照組比較，蘆根多糖干預(yù)A549細(xì)胞后其AKT、PI3K總蛋白表達(dá)無顯著變化(P>0.05)，但p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K比值顯著升高(P<0.01)，結(jié)果見圖3。

A.對照組；B.蘆根多糖組；C.A549細(xì)胞凋亡率；①與對照組比較，P<0.01。

①與對照組比較，P<0.01。

2.4蘆根多糖對A549移植瘤裸鼠模型的體內(nèi)藥效學(xué)研究

2.4.1一般性觀察 在小鼠腋下接種A549細(xì)胞，接種后7 d時(shí)肉眼可見腫瘤，到第13天時(shí)腫瘤體積達(dá)90 mm3，成功率90.0%。移植瘤模型建立后小鼠精神萎靡，食欲不振，活動減少，體質(zhì)量下降。

2.4.2蘆根多糖對A549移植瘤小鼠腫瘤體積及質(zhì)量的影響 移植瘤模型建成后，予以小鼠蘆根多糖治療，觀察其對小鼠腫瘤的影響。與對照組比較，給藥后第9天開始，藥物治療組(蘆根多糖、順鉑)能明顯抑制小鼠腫瘤體積的生長(圖4)，其中順鉑與蘆根多糖組腫瘤生長曲線相似，提示蘆根多糖與順鉑對腫瘤生長具有相似的抑制效果。給藥第18天后，與對照組比較，藥物治療組(蘆根多糖、順鉑)腫瘤質(zhì)量低于對照組，順鉑和蘆根多糖對小鼠腫瘤的抑制率分別為39.1%，35.9%(表1)。

表1 蘆根多糖對A549移植瘤裸鼠腫瘤的抑制率

2.4.3蘆根多糖對A549移植瘤小鼠臟器指數(shù)的影響 臟器指數(shù)是動物臟器的質(zhì)量與其體質(zhì)量之比，主要反映藥物對機(jī)體的毒性。與對照組比較，藥物治療組(蘆根多糖、順鉑)小鼠的肝臟及脾臟指數(shù)無明顯變化(表2)。

①與對照組比較，P<0.01。

表2 蘆根多糖對A549移植瘤小鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響

2.5蘆根多糖對A549移植瘤小鼠Bax、Bcl-2和Caspase-3表達(dá)的影響 利用免疫組化染色檢測蘆根多糖治療后對A549移植瘤小鼠腫瘤組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3表達(dá)的影響，與對照組比較，藥物治療組(順鉑、蘆根多糖)能明顯抑制Bcl-2的表達(dá)(P<0.05)；相反，藥物治療組能顯著促進(jìn)Bax、Caspase-3的表達(dá)(P<0.05)，見圖5。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)經(jīng)典名方對肺癌有一定的抗癌作用，其中蘆根多糖具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多重功效[14]，但其是否亦可抑制NSCLC的增殖仍不清楚。因此，本研究通過動物和離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討了蘆根多糖對A549細(xì)胞及其移植瘤小鼠模型的治療效應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆根多糖可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)細(xì)胞自噬進(jìn)而抑制A549細(xì)胞的增殖和小鼠腫瘤的生長。

考慮到A549細(xì)胞株來源于臨床患者肺腫瘤組織[16]，較為符合臨床特征，而且曾經(jīng)廣泛用于治療肺癌藥物開發(fā)(如紫杉醇、多烯紫杉醇、貝伐單抗等)，受到行業(yè)認(rèn)可。因此，A549細(xì)胞成為肺癌藥物開發(fā)過程中的一種經(jīng)典的篩選模型。為此，本研究利用A549細(xì)胞株建立NSCLC的體外、體內(nèi)模型，用于評價(jià)和探究蘆根多糖抑制NSCLC的藥效作用及其分子機(jī)制。此外，臨床證據(jù)表明順鉑聯(lián)合放療對晚期NSCLC具有良好的治療作用[17]，成為化療藥物中鉑類制劑的首選。因此，選擇順鉑作為NSCLC移植瘤模型的陽性對照藥物。

①與對照組比較，P<0.05；②與對照組比較，P< 0.01。

蘆根味甘，性寒，入肺經(jīng)，善清透肺熱，常用于治肺熱咳嗽、肺癰吐膿、大葉性肺炎等，在中醫(yī)治療肺癌的諸方、民間驗(yàn)方中均有應(yīng)用。蘆根中糖類成分的含量較高，約含51%多糖，前期研究表明蘆根多糖具有抗Hela腫瘤細(xì)胞及B16細(xì)胞活性[18]，提示蘆根多糖可能對肺癌也具有一定的治療作用。鑒于細(xì)胞凋亡和自噬在腫瘤細(xì)胞增殖中具有重要作用[19]，筆者在明確了蘆根多糖可顯著抑制A549細(xì)胞及移植瘤小鼠腫瘤的增殖基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了其發(fā)揮抑制效應(yīng)的潛在機(jī)制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆根多糖可上調(diào)A549細(xì)胞移植瘤小鼠腫瘤組織促凋亡蛋白Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)。提示蘆根多糖可能促進(jìn)A549細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞凋亡效應(yīng)，抑制移植瘤小鼠A549腫瘤組織形成。此外，還發(fā)現(xiàn)蘆根多糖干預(yù)治療后可顯著增加LC-3Ⅱ/Ⅰ比例，且AKT、PI3K磷酸化水平增加，表明蘆根多糖可激活細(xì)胞自噬，抑制A549細(xì)胞增殖，進(jìn)而顯著抑制A549細(xì)胞移植瘤小鼠的腫瘤生長。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘆根多糖對A549細(xì)胞移植瘤小鼠肝臟、脾臟功能無明顯影響，表明蘆根多糖具備潛在的抗癌藥物特性。

綜上所述，蘆根多糖可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬，抑制NSCLC A549細(xì)胞增殖，為其作為一種潛在的NSCLC候選治療藥物。