李清平，劉會群，蔡 萼*

(湖北省荊門市第二人民醫(yī)院 1.病理科； 2.檢驗科, 湖北 荊門 448000)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種起源于B細胞的惡性克隆性漿細胞疾病，其發(fā)病率在血液腫瘤疾病中排名第3位[1]。近年來，MM的發(fā)病率呈增長趨勢，并且患者年齡呈年輕化。隨著硼替佐米、雷利度胺等新藥的應(yīng)用、干細胞移植技術(shù)的成熟以及化療方案的改善，該疾病的治療效果有了很大的提高，但并不能完全治愈[2]。所以，研究新型的治療藥物提高MM的治療療效具有重要意義。黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)是中國傳統(tǒng)中藥黃芪的主要活性成分，具有保護造血系統(tǒng)、抗病毒、抗腫瘤等多方面的藥理功效[3-4]。APS通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的表達抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤RB44細胞的侵襲能力[5]。APS可能通過調(diào)節(jié)PD-1和PD-Ls分子的表達及相互作用抑制荷瘤小鼠皮下黑色素瘤的生長[6]。目前，APS對MM細胞生物學(xué)行為的影響還未見報道。本研究通過探討APS對MM細胞U266增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及可能的作用機制，以期為該疾病治療藥物的研制提供一定的新思路或新方法。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗試劑

多發(fā)性骨髓瘤細胞系U266(上海中美合資博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司)；黃芪多糖APS(南京景竹生物技術(shù)有限公司，純度98%)；胎牛血清(Hyclone公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；CCK-8(日本同仁公司)，Matrigel基質(zhì)膠(Corning公司)；蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒和 Western blot常規(guī)試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；PVDF膜(Millipore公司)；細胞周期蛋白D1(cyclin D1)和p21抗體(Santa Cruz公司)；B淋巴細胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)和B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)抗體(Dako公司)；腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)抗體(上海誠凜生物科技有限公司)；E-cadherin、MMP-2抗體和辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗IgG(北京中杉生物有限公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)；LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogen 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)及分組處理：從液氮罐中取出裝有U266細胞的凍存管，放入37 ℃水浴中，用鑷子夾著凍存管不停搖動使其在1 min內(nèi)快速溶解。轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入適量預(yù)冷的PBS清洗細胞，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞增殖和培養(yǎng)基顏色變化，每2～3 d更換1次新鮮的培養(yǎng)基。取對數(shù)增殖期的U266細胞分組處理。APS組：APS終濃度分別為6、 8和10 mg/mL[7]；對照組(Con組)：培養(yǎng)基；陰性對照組：無細胞，只加培養(yǎng)基。APS 8 mg/mL+pcDNA3.1-TRAF6組：轉(zhuǎn)染TRAF6過表達質(zhì)粒后，8 mg/mL的APS作用U266細胞；APS 8 mg/mL+pcDNA3.1組：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒后，8 mg/mL的APS作用U266細胞。轉(zhuǎn)染具體操作步驟參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖：U266細胞調(diào)整為2.5×104個/mL，每孔100 μL單細胞懸液接種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后，按照1.2.1分組處理后分別培養(yǎng)24、48和72 h，每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，于全自動酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度值(A)。細胞增殖抑制率(%)=[1-(AAPS組-A對照組)/(A陰性對照組-A對照組)]×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡：細胞分組處理后，收集細胞，PBS清洗。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說明，加入400 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，再依次加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.4 Transwell檢測細胞遷移和侵襲：細胞遷移實驗：細胞分組處理后，收集細胞，PBS清洗。用不含血清的培養(yǎng)基重懸，取200 μL細胞懸液(含1×105個細胞)加入至Transwell小室的上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，對穿過小室的細胞數(shù)量進行計數(shù)。細胞侵襲實驗：使用不含血清的培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，鋪設(shè)在Transwell小室的上室，凝固后，再加入細胞懸液。其余操作與細胞遷移實驗相同。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達：取處理后的U266細胞，PBS溶液清洗后，加入不含蛋白酶的RIPA裂解液。置于冰上充分裂解30 min后，4 ℃、12 000×g離心15 min，上清液即為蛋白，采用BCA法測定蛋白含量。取適量蛋白，加入上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白變性。取變性后的蛋白質(zhì)，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，使用5%脫脂牛奶在室溫條件下進行封閉2 h。然后，加入稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜。PBS溶液清洗后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗IgG，室溫條件孵育1 h。PBS溶液清洗后加入ECL顯影液，避光顯影。使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image Pro Plus 6.0軟件分析蛋白條帶吸光度值。以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白的表達水平以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶吸光度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的APS對U266細胞增殖的影響

與對照組比，APS組抑制率顯著升高(P<0.05)，且呈時間和劑量依賴性(P<0.05)(圖1A)；U266細胞中cyclin D1蛋白表達水平降低(P<0.05)，p21蛋白表達水平升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖1B，C)。此外，濃度為8 mg/mL的APS作用U266細胞48 h時，對U266細胞的抑制率約為50%，因此選擇8 mg/mL的APS作用U266細胞48 h進行后續(xù)試驗。

2.2 APS對U266細胞凋亡的影響

與對照組相比，APS 8 mg/mL組U266細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)(圖2)。

2.3 APS對U266細胞遷移、侵襲的影響

與對照組比，APS 8mg/mL組U266細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著減少(P<0.05)(圖3A)，E-cadherin蛋白表達顯著升高(P<0.05)，MMP-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)(圖3B，C)。

2.4 APS對U266細胞中TRAF6表達的影響

與對照組相比，APS 8mg/mL組U266細胞中TRAF6蛋白表達顯著降低(P<0.05)(圖4)。

A,C.effect of APS on the expression of U266 cell proliferation-related proteins; B.effect of APS on the inhibition rate of U266 cells; *P<0.05 compared with the Con group; #P<0.05 compared with the APS 6 mg/mL group; △P<0.05 compared with the APS 8 mg/mL group

A,B.effect of APS on E-cadherin and E-cadherin protein expression in U266 cells; C.effect of APS on the number of migration and invasive cells; *P<0.05 compared with the Con group

*P<0.05 compared with the Con group圖4 APS對U266細胞中TRAF6表達的影響Fig 4 Effect of APS on the expression of TRAF6

2.5 過表達TRAF6降低了APS對U266細胞增殖、凋亡的影響

分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、pcDNA3.1-TRAF6至U266細胞，然后使用8 mg/mL的APS作用轉(zhuǎn)染后的細胞，APS 8 mg/mL+pcDNA3.1-TRAF6組U266細胞中TRAF6蛋白表達顯著高于APS 8 mg/mL+pcDNA3.1組(P<0.05)。培養(yǎng)相同的時間，與APS 8 mg/mL+pcDNA3.1組比，APS 8 mg/mL+pcDNA3.1-TRAF6組U266細胞抑制率顯著降低(P<0.05)(圖5A)，凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖5B)，cyclin D1和Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，p21和Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)(圖5C，D)。

2.6 過表達TRAF6降低了APS對U266細胞遷移、侵襲的影響

與APS 8 mg/mL+pcDNA3.1組比，APS 8 mg/mL+pcDNA3.1-TRAF6組U266細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著增加(P<0.05)(圖6A)，E-cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)(圖6B)，MMP-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)(圖6B，C)。

3 討論

MM的病情發(fā)展較為迅速，尚不能完全治愈，患者中位生存期為3～4年[8]。在骨髓瘤的治療中，中藥可以作為化療輔助治療的藥物。目前，已有研究顯示，黃芩苷[9]、三七總皂苷[10]等中藥活性成分可有效的影響骨髓瘤細胞增殖、遷移和侵襲的惡性生物學(xué)行為。作為中藥黃芪的主要有效活性成分，APS具有抗腫瘤活性。如APS可能通過降低P65的轉(zhuǎn)錄活性抑制人肺癌細胞系A(chǔ)549增殖，抑制移植瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤生長[11]。APS能夠抑制宮頸癌HeLa細胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并能夠通過調(diào)節(jié)自噬增強HeLa細胞對順鉑的敏感性[12]。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，APS能夠提高骨髓瘤細胞U266抑制率，且具有劑量和時間依賴性，減少U266細胞遷移和侵襲數(shù)量，提高U266細胞凋亡率， 并下調(diào)cyclin D1、Bcl-2、MMP-2和TRAF6蛋白表達，上調(diào)p21、Bax、和E-cadherin蛋白表達，表明APS能夠抑制U266細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并促進其凋亡，提示APS具有開發(fā)為骨髓瘤治療藥物的潛力。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)是腫瘤壞死因子受體家族成員之一，可調(diào)控成骨細胞分化、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生命過程，在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。小白菊內(nèi)酯通過與TRAF6直接結(jié)合抑制NF-κB信號通路的激活，從而抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡[13]。骨髓瘤細胞中TRAF6表達水平顯著升高，沉默TRAF6表達可能通過影響NF-κB等信號通路抑制骨髓瘤細胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，APS可降低骨髓瘤細胞U266中的TRAF6蛋白表達，過表達TRAF6逆轉(zhuǎn)了APS對U266細胞增殖、遷移和侵襲以及凋亡的影響，提示APS可能通過下調(diào)U266細胞中TRAF6表達抑制其增殖、遷移和侵襲，并促進其凋亡。

A,B.over-expression of TRAF6 reduced the effect of APS on U266 cells proliferation and apoptosis-related protein expression; C.over-expression of TRAF6 reduced the effect of APS on the apoptosis rate of U266 cells;D.over-expression of TRAF6 reduced the effect of APS on the inhibition rate of U266 cells; *P<0.05 compared with Con group; #P<0.05 compared with APS 8mg/ml+pcDNA3.1 group

A,B.over-expression of TRAF6 reduced the effect of APS on E-cadherin and E-cadherin protein expression in U266 cells; C.over-expression of TRAF6 reduced the effect of APS on U266 cell migration and invasion cells; *P<0.05 compared with Con group; #P<0.05 compared with APS 8 mg/mL+pcDNA3.1 group

綜上所述，APS能夠抑制骨髓瘤細胞U266的增殖、遷移和侵襲能力，并誘導(dǎo)其凋亡，其可能通過下調(diào)TRAF6表達發(fā)揮作用，是治療骨髓瘤的潛在藥物。