張文婷，王 瑾，岳繼萍，靳文文，張志楠，焦向英

(山西醫(yī)科大學 生理學系，山西 太原 030001)

胰島β細胞功能障礙[1]和數(shù)量減少[2]是糖尿病發(fā)病機制中的關鍵因素，因此，抑制胰島β細胞數(shù)量減少，促進其增殖對糖尿病的治療至關重要。

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)與GLP-1受體(GLP-1 receptor， GLP-1R)的結合可促進胰島β細胞的增殖[3]，抑制其凋亡[4]。但GLP-1R在糖尿病中表達降低[5]，那么，糖尿病中GLP-1對胰島β細胞的增殖效應是否會有變化？

糖尿病中硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)的表達顯著上調[6]，且其不但可抑制腫瘤細胞[7]的增殖，還可下調核轉錄因子Mafa的表達[8]，而Mafa能夠調節(jié)胰島β細胞上GLP-1R的表達[9]，那么，GLP-1的增殖效應是否會受TXNIP的影響？因此，推測TXNIP可通過抑制GLP-1R的表達進而影響GLP-1對胰島β細胞的增殖效應。為此，本研究在db/db鼠和MIN6細胞上進行探究，以期尋求糖尿病治療新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物、細胞及載體：SPF級C57BLKS/JNju db/m、db/db小鼠，雄性，體質量28～35 g[江蘇集萃藥康生物科技有限公司，生產許可證號SCXK(蘇)2018-0008]；MIN6 C57BL/6小鼠胰島β細胞株(北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院)。慢病毒載體：pLV[shRNA]-mCherry: T2A: Puro-U>rTXNIP [shRNA#1]；pLV [Exp]-EGFP: Puro-Null；pLV [Exp]-EGFP: Puro-EF1A>rTXNIP [NM-001008767.1]，由廣州賽業(yè)公司包裝完成。

1.1.2 試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(Cellmax公司)，蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術有限公司)，GLP-1 ELISA試劑盒(博士德生物公司)，小鼠抗大鼠PCNA抗體和兔抗大鼠TXNIP抗體(CST公司)，豚鼠抗大鼠anti-insulin抗體、小鼠抗大鼠anti-glucagon抗體、兔抗大鼠anti-Ki67抗體和兔抗大鼠anti-GLP-1R抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：分為db/m組和db/db組小鼠，每組10只，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒轉染MIN6細胞：選擇對數(shù)期的MIN6細胞，分為對照組、Ad-GFP組和Ad-TXNIP-GFP組。各加2 mL 完全培養(yǎng)基，除對照組外，各組病毒分別加50 μL。約6 h后，每組換5 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察轉染情況。待24 h后加入含3 μg/mL嘌呤霉素(puromycin, PM)的培養(yǎng)基進行抗性篩選，顯微鏡觀察，當轉染率達90%以上時，停止抗性篩選，表明TXNIP過表達穩(wěn)轉細胞株構建成功。在Ad-GFP組和Ad-TXNIP-GFP組中分別加入1×10-8mol/L GLP-1受體激動劑利拉魯肽(liraglutide)，分為對照組、Ad-GFP組、Ad-TXNIP-GFP組、Ad-GFP+liraglutide組和Ad-TXNIP-GFP+liraglutide組，培養(yǎng)48 h，收集蛋白，檢測PCNA和Ki67，n值為6。

1.2.3 Western blot檢測TXNIP、PCNA和GLP-1R蛋白表達水平：在體水平，取0.05 g胰腺組織，加入500 μL裂解液(含PMSF 5 μL)，充分剪碎。離體水平，用200 μL含EDTA的胰蛋白酶消化MIN6細胞1 min，4 000 r/min離心，5 min，棄上清，每管加入100 μL裂解液和1 μL PMSF，吹散，細胞超聲破碎儀破碎。4 ℃裂解、離心取上清，BCA法檢測蛋白濃度。上樣，電泳，轉膜，封閉2 h，加一抗4 ℃過夜。二抗孵育2 h，曝光機曝光。用Image J 得各個條帶吸光度值，以β-actin為內參進行分析。

1.2.4 免疫組織化學檢測GLP-1R蛋白表達水平：取新鮮的胰腺組織固定，包埋，切片?？酒蠖妆矫撓灒掖继荻让撍?。用雙氧水滅活，檸檬酸鈉進行抗原修復，5% BSA血清封閉，4 ℃孵一抗過夜。孵育生物素化二抗，孵育SABC，DAB顯色，蘇木精染核，中性樹膠封片。

1.2.5 HE染色觀察胰島結構：按照蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒說明書進行操作。

1.2.6 組織免疫熒光雙標檢測胰島細胞的數(shù)量：胰腺組織冰凍切片，丙酮-20 ℃固定20 min，滴加10%山羊血清37 ℃封閉30 min。滴加一抗，4 ℃過夜。避光滴加熒光二抗，37 ℃孵育1 h，滴加含DAPI的防衰減封片劑，封片。

1.2.7 夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測小鼠血清中GLP-1的表達：加100 μL小鼠血清和標準品，37 ℃反應90 min。加生物標記抗體，37 ℃反應60 min，加ABC工作液，37 ℃反應30 min，加90 μL TMB顯色液，37 ℃避光反應20～25 min。加TMB終止液，用酶標儀在450 nm處測定A值并計算其濃度。

1.2.8 細胞免疫熒光檢測GLP-1R和Ki67蛋白表達水平：取對數(shù)增殖期細胞，消化，爬片，待24 h后，多聚甲醛固定15 min，0.05% Triton-100室溫通透40 s，滴加10%山羊血清，37 ℃封閉30 min，孵一抗，過夜。避光孵二抗，室溫避光1 h，滴加抗衰減封片劑，室溫孵育5 min后，拍片。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 db/db鼠胰島結構破壞且β細胞數(shù)量減少，胰腺組織PCNA表達降低

db/db鼠胰島形狀不規(guī)則，結構破壞嚴重(圖1A)。與db/m鼠相比，db/db鼠胰島β細胞數(shù)量減少(圖1B)。db/db鼠胰腺組織PCNA表達降低(P<0.05)(圖1C)。

A.HE staining of pancreatic tissue of db/m and db/db mice, scale bar=50 μm; B.immunofluorescence staining of islet of db/m and db/db mice, scale bar=100 μm; C.PCNA protein expression was detected by Western blot; *P<0.01 compared with db/m group

2.2 db/db鼠血清GLP-1水平降低，胰島GLP-1R水平降低

db/db鼠血清中GLP-1的水平明顯降低(圖2A)(P<0.05)。db/db鼠胰腺組織內GLP-1R蛋白水平低于db/m鼠(圖2B)(P<0.05)。db/db鼠胰島內GLP-1R水平顯著低于db/m鼠(圖2C)。

2.3 db/db鼠胰腺組織TXNIP表達升高

與對照組db/m鼠相比，db/db鼠胰腺組織中TXNIP的蛋白表達顯著升高(P<0.05)(圖3)。

2.4 TXNIP過表達細胞模型構建成功

用慢病毒轉染MIN6小鼠胰島細胞，構建TXNIP過表達穩(wěn)轉細胞系。熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)GFP高表達，慢病毒轉染成功(圖4A)。Ad-TXNIP-GFP組TXNIP的表達明顯高于對照組和Ad-GFP組(圖4B)(P<0.05)。

2.5 TXNIP過表達引起胰島β細胞的GLP-1R水平降低

Ad-TXNIP-GFP組GLP-1R蛋白水平明顯低于對照組和Ad-GFP組(圖5A)(P<0.05)。細胞免疫熒光結果與其一致(圖5B)。

A.GLP-1 levels were detected in serum by ELISA; B.GLP-1R protein expression was detected by Western blot, *P<0.05 compared with db/m group; C.GLP-1R protein expression was detected by immunohistochemical staining, scale bar=100 μm

TXNIP protein expression was detected by Western blot; *P<0.05 compared with db/m group圖3 db/db小鼠胰腺組織TXNIP表達升高Fig 3 TXNIP expression was increased in pancreatictissue of db/db n=6)

2.6 TXNIP過表達使GLP-1對胰島β細胞的增殖效應降低

與Ad-GFP組相比，Ad-TXNIP-GFP組細胞PCNA蛋白表達明顯降低(P<0.05)，Ad-GFP+liraglutide組PCNA蛋白表達升高(P<0.05)，但與Ad-GFP+liraglutide組相比，Ad-TXNIP-GFP+liraglutide組PCNA蛋白水平明顯下降(P<0.05)(圖6A)。增殖相關指標Ki67與PCNA變化一致(圖6B)。

3 討論

糖尿病的發(fā)病機制包括胰島β細胞的功能惡化[1]、凋亡增加及增殖減弱。因此，抑制胰島β細胞數(shù)量減少，促進其增殖有望成為治療糖尿病的靶點之一。

A.fluorescence microscopy observates of GFP expression, scale bar=100 μm; B.TXNIP protein expression was detected by Western blot; *P<0.05 compared with Ad-GFP group

A.GLP-1R protein expression was detected by Western blot; *P< 0.05 compared with Ad-GFP; B.representative images show the expression level of GLP-1R (red) and DAPI (blue), scale bar=100 μm

大量研究表明，GLP-1能顯著促進胰島β細胞的增殖[10]。本課題發(fā)現(xiàn)db/db鼠中GLP-1和GLP-1R的表達均低于db/m鼠，進一步研究發(fā)現(xiàn)TXNIP的表達升高[6]，db/db鼠胰島結構破壞，β細胞數(shù)量減少，胰腺組織增殖降低，但其機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interact-ing protein，TXNIP)能抑制腫瘤細胞[7]的增殖。而GLP-1激動劑能下調TXNIP的表達[11]，那么TXNIP可能會對GLP-1促增殖作用的發(fā)揮產生影響。此外，TXNIP具有下調某些核轉錄因子如Mafa、STAT3[8]等的能力，故本研究推測其可能會影響胰島β細胞GLP-1R的表達。

A.PCNA protein expression was detected by Western blot, *P<0.05 compared with Ad-GFP, #P<0.05 compared with Ad-TXNIP-GFP group, △P<0.05 compared with Ad-GFP +liraglutide group; B.the expression level of Ki67 (red) and DAPI (blue) was detected by fluorescence microscope, scale bar=100 μm

為此，本課題用慢病毒轉染小鼠胰島β細胞系，TXNIP過表達穩(wěn)轉細胞株構建成功。在此基礎上，本研究檢測了GLP-1R的表達，發(fā)現(xiàn)TXNIP過表達時細胞的GLP-1R水平降低，提示TXNIP可以下調GLP-1R的表達。

除PCNA外，Ki67作為存在于增殖細胞中的核抗原，也被用作細胞增殖的標記。因此，本研究檢測PCNA和Ki67的表達，發(fā)現(xiàn)TXNIP過表達時PCNA和Ki67表達均降低，提示TXNIP可抑制胰島β細胞增殖。為進一步探究TXNIP能否影響GLP-1對胰島β細胞的增殖效應，給予GLP-1受體激動劑利拉魯肽干預，發(fā)現(xiàn)TXNIP過表達可使GLP-1對胰島β細胞的增殖效應降低。

綜上所述，db/db鼠中TXNIP表達升高能降低胰島β細胞上GLP-1R的表達，進而降低GLP-1對胰島β細胞的增殖效應。該結果有望為糖尿病的治療提供新靶點。