宋志明，余舒杰，焦 潔，李平平，李紅梅，錢孝賢*

(1.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心內(nèi)科， 河南 開封 475001； 2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 心內(nèi)科，廣東 廣州 510630)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的病理基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷是AS形成的重要機(jī)制之一，早于動脈粥樣硬化形態(tài)學(xué)改變，在心血管病的預(yù)測和防治方面具有極其重要

的意義[1-2]。氧化應(yīng)激會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂，從而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生[3]。細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion mole-cule-1, VCAM-1)參與AS的形成[4]，但其作用機(jī)制尚不清楚。人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1，gRb1)已經(jīng)被證實(shí)具有內(nèi)皮細(xì)胞功能保護(hù)作用[5-6]。

本研究擬建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells ,HUVECs)氧化損傷模型，探討gRb1的藥理效果，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

gRb1(HPLC 98.1%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；H2O2、MTT、DMSO(Sigma-Aldrich公司)；異丙醇、無水乙醇(廣州化學(xué)試劑廠)；Ⅰ型膠原酶、無血清培養(yǎng)基、M199培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)；內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(BD公司)；細(xì)胞裂解液、蛋白定量試劑盒和凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；抗ICAM-1抗體(Cell Signaling Technology 公司)；抗VCAM-1抗體(Santa Cruz 公司)；抗GAPDH內(nèi)參抗體(Proteintech Group公司)；小鼠及兔Ⅱ抗(武漢博士德生物工程有限公司)；分型SOD活性及MDA檢測試劑盒(南京建成生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分離培養(yǎng):原代HUVECs分離培養(yǎng)見既往報(bào)道[7]。若無特殊交代，研究所用細(xì)胞均為1～3代。本研究經(jīng)河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，符合Helsinki原則。

1.2.2 細(xì)胞的分組與處理:H2O2氧化損傷誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞分為對照組和不同濃度的H2O2(20、40、80和160 μmol/L)組。gRb1氧化損傷保護(hù)實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞分為對照組，H2O2(80 μmol/L)組和不同濃度的gRb1(10、20和40 μmol/L)組。細(xì)胞處理：取對數(shù)增殖的細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行接種，培養(yǎng)24 h后加藥刺激。按照不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康模铀庬樞驗(yàn)椋篻Rb1作用0.5 h后加入H2O2培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞上清液、細(xì)胞和蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率:細(xì)胞處理結(jié)束后，加入20 μL MTT(5 mg/mL)培養(yǎng)4 h；去除培養(yǎng)基后，每孔加入150 μL 的DMSO，用錫箔紙遮蓋后置于搖床上15 min充分搖勻。最后在490 nm處，用酶標(biāo)儀讀取各孔的吸光度值(A490)，計(jì)算存活率。

存活率=實(shí)驗(yàn)組A490值/對照組A490值。

1.2.4 流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡:操作過程見參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.5 SOD1活性及MDA含量的測定:用黃嘌呤氧化酶法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD1活性；用硫代巴比妥比色法(TBA法)測定MDA含量。操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 Western blot檢測ICAM-1和VCAM-1蛋白:吸去培養(yǎng)基收集細(xì)胞，用1×磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2～3遍，加50～60 μL 細(xì)胞裂解液，低溫孵育10 min，刮下細(xì)胞，將細(xì)胞裂解物吸至1.5 mL離心管中，4 ℃下以13 200 r/min離心15 min；吸取上清，分裝保存以備后用。BCA蛋白定量后，取等量總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移到NC膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應(yīng)抗體，4 ℃搖床過夜孵育；棄去Ⅰ抗，1×TBST洗5 min×3次，加入小鼠或兔Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗3次后ECL顯影，最后用Quantity One 軟件掃描并分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氧化損傷模型H2O2濃度的選擇

與對照組相比，40、80和160 μmol/L H2O2顯著抑制細(xì)胞存活率為64.2%±15.3%、53.3%±15.1%、25%±10.9%。將存活率轉(zhuǎn)換為抑制率，測算得出IC50為78.62 μmol/L。因此，80 μmol/L H2O2為建立損傷模型的最佳濃度。

2.2 gRb1對細(xì)胞存活率的影響

與對照組相比，H2O2組細(xì)胞存活率明顯受到抑制(P<0.05)。與H2O2組對比，20和40 μmol/L gRb1均能顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，且以20 μmol/L gRb1最為明顯(P<0.05)(圖1)。后續(xù)研究以20 μmol/L gRb1探討其對細(xì)胞的保護(hù)作用。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with H2O2 group圖1 不同濃度gRb1處理對細(xì)胞活力的影響Fig 1 Effects of gRb1 with different dosages on cell

2.3 gRb1對細(xì)胞凋亡的影響

與對照組相比，H2O2組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。與H2O2組相比，gRb1組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖2)。

2.4 gRb1對細(xì)胞SOD1活性和MDA含量的影響

與對照組相比，H2O2組SOD1活性明顯降低，MDA含量明顯增加(P<0.05)。與H2O2組相比，gRb1組SOD1活性明顯升高，MDA含量明顯下降(P<0.05)(圖3)。

2.5 gRb1對細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，H2O2組細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)。與H2O2組相比，gRb1組ICAM-1及VCAM-1蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05)(圖4)。

3 討論

動脈粥樣斑塊組織中存在大量凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞，這是細(xì)胞黏附分子產(chǎn)生以及單核、泡沫細(xì)胞黏附的主要機(jī)制。因此，內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷和凋亡已被公認(rèn)為與心血管疾病的發(fā)生存在密切聯(lián)系[8]。

內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型是闡明內(nèi)皮損傷機(jī)制的重要工具，而H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型為目前廣泛應(yīng)用的研究內(nèi)皮損傷的模型[9]。本研究通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞存活率的檢測，最終確定80 μmol/L H2O2為損傷模型的最佳濃度。

人參自古以來就被認(rèn)為是一種增強(qiáng)機(jī)體抵抗力的中藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和藥理研究表明, 人參皂苷為人參的主要有效成分， gRb1是含量最多的一種[10]。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with H2O2 group圖2 gRb1處理對H2O2損傷的HUVECs細(xì)胞凋亡的影響Fig 2 Effect of gRb1 on apoptosis of HUVECs injured by

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with H2O2 group圖3 gRb1處理對細(xì)胞SOD1和MDA的影響Fig 3 Effect of gRb1 on the SOD1 activity and MDA

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with H2O2 group圖4 gRb1對細(xì)胞內(nèi)ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effect of gRb1 on protein expression of ICAM-1 and

既往研究發(fā)現(xiàn)，gRb1能夠改善自然衰老小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平[11]。本研究顯示，氧化損傷的內(nèi)皮細(xì)胞中SOD活性減低，MDA含量增加。而gRb1能夠增加SOD活性，同時(shí)減少M(fèi)DA生成。

內(nèi)皮細(xì)胞的異常凋亡是內(nèi)皮損傷的生理反映，而ICAM-1和VCAM-1是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要標(biāo)志[12]。本研究顯示，在氧化損傷中，內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡異常增加，ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達(dá)也大幅增加。gRb1能夠減少內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞表面黏附分子的合成。

本研究結(jié)果顯示，gRb1能夠通過減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激水平和黏附分子的合成發(fā)揮其改善H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。后續(xù)的研究將進(jìn)一步利用特異性抑制劑或基因沉默技術(shù)進(jìn)一步闡釋相關(guān)機(jī)制。