李金鳳，李小承，殷小紅，馬衛(wèi)國，李 亞

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，陜西 西安 710075)

小熱休克蛋白家族(small heat shock proteins,sHSPs)是一類分子質(zhì)量為15～45 ku的熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)。在哺乳動(dòng)物中sHSPs又被稱作HSPB家族，已明確的包括10個(gè)成員即HSPB1-HSPB10[1]。作為分子伴侶的sHSPs，廣泛表達(dá)于動(dòng)物組織中，在高糖等應(yīng)激條件下，部分表達(dá)量升高，參與與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的結(jié)合[2]，通過調(diào)節(jié)自噬途徑影響蛋白質(zhì)合成和降解的速率，維持正常細(xì)胞蛋白穩(wěn)態(tài)[3]。據(jù)研究小熱休克蛋白與糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病關(guān)系密切，且作為小熱休克蛋白家族一員的HSPB8，高表達(dá)于神經(jīng)組織中，參與BAG3介導(dǎo)的巨自噬過程，與多種神經(jīng)退行性病變發(fā)病相關(guān)[4]。但目前系統(tǒng)研究小熱休克蛋白家族在海馬組織中表達(dá)情況的課題較少，本課題將初步篩查自發(fā)2型糖尿病小鼠模型 (db/db) 小鼠海馬組織與正常小鼠海馬組織中是否存在小熱休克蛋白家族mRNA表達(dá)水平差異。并重點(diǎn)檢測HSPB8、BAG3、P62和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)情況，了解8周齡db/db小鼠海馬組織中是否存在BAG3介導(dǎo)的自噬改變。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：SPB級，雄性，8周齡, db/db小鼠及正常野生型(db/m) 小鼠各10只，即db/db 糖尿病小鼠和表型正常的db/m小鼠(lepr-/m)[南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院提供，合格證編號：SCXK(黑)2018-0008]，監(jiān)測小鼠體質(zhì)量及日血糖，將對照組、模型組小鼠頸椎脫臼處死, 立即低溫條件取小鼠海馬組織，迅速液氮冷凍后，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.1.2 試劑：HSPB1-HSPB10、LC3和P62引物(奧科鼎盛生物公司)；EasyScript First Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物有限公司)、兔抗鼠 HSPB8，BAG3、P62和LC3抗體(Proteintech 公司)；兔抗鼠Actin山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR(real-time PCR)檢測HSPB1-HSPB10、自噬基因mRNA表達(dá)：收集海馬組織用勻漿機(jī)TransZol裂解,依TransZol總RNA抽提試劑盒說明提取RNA, RNA溶于無核酸酶水中NanoDrop 2 000c測定核酸濃度，用EasyScript First Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將1 μg的cDNA進(jìn)行qPCR，同時(shí)使用同種屬的β-actin作為內(nèi)參。常規(guī)進(jìn)行RT-PCR 檢測，結(jié)果的相對定量值計(jì)算公式：2-[(實(shí)驗(yàn)組-GAPDH)-(對照組-GAPDH)]。特定引物序列(5′-3′)(表1)。

表1 實(shí)時(shí)定量 PCR 所用引物Table 1 Quantitative PCR primer sequences

1.2.2 Western blot檢測HSPB8、BAG3、P62和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)：取海馬組織指甲蓋大小，秤取重量，按50 mg/mL加入相應(yīng)體積的細(xì)胞裂解液RIPA，無菌剪刀剪碎組織，置于冰上勻漿，冰上裂解15 min，14 000×g離心5 min，取上清液；用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)10% SDS-PAGE 電泳分離蛋白質(zhì)后，恒壓25 V半干轉(zhuǎn)膜20 min，將含有蛋白質(zhì)的PVDF膜在7.5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，一抗4 ℃搖床過夜(actin抗體1∶800稀釋，BAG3抗體1∶2 000稀釋，LC3、P62蛋白抗體1∶800稀釋)，PBST 洗膜4 次，每次10 min；二抗室溫?fù)u床1 h(二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，1∶2 000 稀釋)，PBST洗膜4次后，ECL顯影。以β-actin為內(nèi)參，圖像分析軟件Image J進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 db/db小鼠體質(zhì)量及血糖變化

db/db小鼠體質(zhì)量及血糖較db/m組顯著升高(P<0.01)(表2)。

表2 db/m及db/db組小鼠體質(zhì)量及血糖對比

2.2 Real-time PCR檢測db/db組與db/m組sHSPs及LC3、P62 mRNA表達(dá)

小熱休克蛋白家族基因mRNA在db/db和db/m小鼠海馬組織中均有表達(dá)。 與db/m組相比，db/db小鼠中HSPB1、HSPB3、HSPB5、HSPB6和HSPB8的表達(dá)較低(P<0.05)(表3)。而HSPB2、HSPB9和HSPB10表達(dá)較db/m組高(P<0.05)(表4)。其次，db/db和db/m海馬組織中均有LC3及P62表達(dá), LC3在db/db小鼠中的表達(dá)均高于db/m組，P62表達(dá)反之，提示在8周齡糖尿病小鼠海馬組織中可能存在自噬改變(P<0.05)(表5)。

表5 db/m組、 db/db組中 HSPB4、HSPB7、LC3和P62 mRNA 表達(dá)Table 5 Expressions of HSPB4, HSPB7，LC3 and P62 in db/m and db/db

表3 db/m、db/db 組中HSPB1、 HSPB3、 HSPB5、HSPB6和HSPB8 mRNA的表達(dá)Table 3 Expressions of HSPB1, HSPB3, HSPB5, HSPB6 and HSPB8 in db/m and db/db

表4 db/m組、 db/db組中 HSPB2、HSPB9和 HSPB10 mRNA 表達(dá)

2.3 Western blot檢測HSPB8、BAG3、P62、LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)

與db/m組相比，db/db組HSPB8、BAG3和LC3-Ⅱ表達(dá)均增高(P<0.01)，而P62蛋白表達(dá)降低(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with db/m圖1 實(shí)驗(yàn)組及對照組中BAG3、HSPB8、LC3Ⅱ和P62蛋白表達(dá)Fig 1 Expression of BAG3, HSPB8, LC3-Ⅱ and P62 proteins in experimental group and control

3 討論

小熱休克蛋白(sHSPs)由80～100個(gè)氨基酸殘基的保守序列構(gòu)成，其特征為保守的C-末端α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域[5]，sHSPs蛋白的活性由絲氨酸殘基的磷酸化晶狀體蛋白介導(dǎo)。sHSPs在不同組織中表達(dá)存在差異，如HSPB5主要在晶狀體結(jié)構(gòu)中高表達(dá)；HSPB2(MKBP)和HSPB3在心肌和骨骼肌中高表達(dá)。HSPB9、HSPB10在睪丸中高表達(dá)[6]。也有報(bào)道HSPB1、HSPB2、HSPB3、HSPB5、HSPB6和HSPB8基因均在大鼠腦組織及海馬神經(jīng)元中表達(dá)[7]。

眾多研究表明sHSPs與糖尿病關(guān)系密切。例如，HSPB4、HSPB5、HSPB6和HSP8在糖尿病視網(wǎng)膜中表達(dá)，參與慢性糖尿病中視網(wǎng)膜神經(jīng)元的保護(hù)[8]。HSPB2、HSPB3和HSPB5在慢性高血糖作用下的小鼠心肌細(xì)胞中表達(dá)增加[9]。HSPB6表達(dá)下降可能導(dǎo)致糖尿病引起的心臟損傷。而HSPB5過表達(dá)可顯著減輕糖尿病模型小鼠的心臟損傷[10]。HSPB1在2型糖尿病腎病患者血漿中表達(dá)升高，且HSPB1可能作為糖尿病腎病的標(biāo)志物[11]。然而，目前針對小熱休克家族在糖尿病海馬組織中的研究較少。本課題首次研究，發(fā)現(xiàn)小熱休克蛋白家族成員基因mRNA均在db/m及db/db組小鼠海馬中表達(dá)，且存在差異，較db/m組，HSPB1、HSPB3、HSPB5、HSPB6和HSPB8轉(zhuǎn)錄水平降低，提示這可能與高糖對海馬神經(jīng)元損傷相關(guān)，而HSPB2、HSPB9和HSPB10轉(zhuǎn)錄水平升高，可能參與高糖刺激時(shí)海馬神經(jīng)元的應(yīng)激保護(hù)。

小熱休克蛋白家族與自噬關(guān)系密切。近年HSPB8參與Bcl-2相關(guān)抗凋亡基因3(Bcl-2 associ-ated athanogene 3，BAG3)介導(dǎo)的選擇性自噬被廣泛研究[12]。

作為補(bǔ)充泛素-蛋白酶體系統(tǒng)可降解一些細(xì)胞中突變、損傷及錯(cuò)誤折疊的蛋白。 識別底物后，BAG3，HSPB8，HSP70和CHIP/STUB1形成伴侶輔助的選擇性自噬(CASA)復(fù)合物，CASA復(fù)合物與自噬受體SQSTM1/p62相互作用，并與LC3 (LC3-Ⅱ)作用將靶向蛋白結(jié)合到自噬體上對底物進(jìn)行降解[13]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病中樞病變的發(fā)生與自噬關(guān)系密切， 如在海馬C1區(qū)糖尿病大鼠LC3及P62表達(dá)均上調(diào)，提示自噬活性減弱[14]。也有報(bào)道自噬可使海馬神經(jīng)細(xì)胞免于高糖毒性損害；且高糖可削弱海馬神經(jīng)元中自噬體合成，進(jìn)而減少自噬通量，抑制自噬[15]。然而目前就db/db小鼠海馬組織中BAG3介導(dǎo)的選擇性自噬尚未見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)8周齡糖尿病小鼠海馬組織中HSPB8蛋白表達(dá)升高，且BAG3、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)升高，而P62蛋白表達(dá)減低，提示8周齡小鼠海馬組織中， HSPB8蛋白表達(dá)升高，自噬激活。此結(jié)果與LI等[13]研究SMZ小鼠神經(jīng)組織中的研究一致。其具體機(jī)制期待將是進(jìn)一步研究的課題。