倪安妮，梁清洋，姚鴻飛，李根亮*，唐玉蓮

(右江民族醫(yī)學(xué)院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生化教研室； 2.臨床醫(yī)學(xué)院 骨科， 廣西 百色 533000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上第6大最常見的癌，也是第3大癌死亡原因[1]?；ㄉ南┧?arachidonic acid，AA)代謝過程在腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[2]。環(huán)氧化酶P450途徑(epoxygenase P450 pathway，EPP)是AA的一種代謝途徑，環(huán)氧化酶P450蛋白及mRNA表達(dá)水平與癌細(xì)胞表達(dá)水平正相關(guān)[3]。環(huán)氧化酶P450主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或線粒體膜與特定的磷脂結(jié)合，這些膜由磷脂雙分子層組成，可通過產(chǎn)生脂質(zhì)微區(qū)影響環(huán)氧化酶P450的功能[4]。環(huán)氧化酶P450的活性中心是含有鐵卟啉結(jié)構(gòu)的血紅素，活性中心的鐵離子傳遞電子在環(huán)氧化酶P450參與生命活動的氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[5]。因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上氧化酶P450的鐵離子結(jié)合(iron ion bonding，IIB)對EPP的作用、對AA代謝，及對癌的發(fā)生產(chǎn)生影響。然而，在HCC微環(huán)境中花生四烯酸(AA)代謝中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)基因的功能還未見報道。本研究應(yīng)用小鼠HCC模型，采用RNA-seq和生物信息學(xué)分析花生四烯酸(AA)代謝相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜基因在HCC微環(huán)境中的表達(dá)情況及參與AA代謝的差異表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜基因(AA metabolism differentially expressed endoplasmic reticulum genes，ADEGs)的功能，并用RT-qPCR驗證內(nèi)質(zhì)ADEGs的表達(dá)情況，并通過HCC微環(huán)境中ADEGs位點多態(tài)性分析其與基因表達(dá)的可能相關(guān)性。研究結(jié)果對理解HCC的發(fā)生機制具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：潔凈級6周雌雄各半昆明小鼠100只，體質(zhì)量(30±5)g[長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(湘)2019-0014]。

1.1.2 實驗試劑和耗材：H22細(xì)胞系(小鼠肝癌細(xì)胞系)(南京凱基生物科技有限公司)；RNA提取試劑盒(Invitrogen 公司)；Cyp2b9、Cyp2c39、Gpx8、Gapdh引物(上海生工生物工程股份有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：細(xì)胞系H22在1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)48 h后通過細(xì)胞計數(shù)儀檢測活細(xì)胞密度達(dá)到105～106個/10 μL，按細(xì)胞原液：0.9%氯化鈉溶液=1∶1至1∶10稀釋，放置室溫?zé)o菌條件下待用。隨機選取100只昆明小鼠，每只用配好的細(xì)胞懸液1×106～3×106個/0.1 mL在層流柜中腋下注射成瘤，飼養(yǎng)4周后，取腫瘤組織和癌旁組織。

1.2.2 RNA提取和測序：兩組(n=40)樣本組織各取50 μg，RNA質(zhì)量檢測、反轉(zhuǎn)錄、文庫構(gòu)建及測序數(shù)據(jù)的處理按常規(guī)程序進(jìn)行。

1.2.3 花生四烯酸(AA)相關(guān)差異基因(DEGs)的篩選：通過DAVID 6.8在線軟件搜索AA代謝信號通路中所有基因，與測序數(shù)據(jù)中的DEGs比較，篩選出兩樣本中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)的AA代謝相關(guān)基因。

1.2.4 AA相關(guān)DEGs的功能富集分析：采用DAVID 6.8在線軟件進(jìn)行功能富集，分析其功能。

1.2.5 AA相關(guān)DEGs編碼蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析：采用STRING 11.0在線軟件對內(nèi)ADEGs編碼的蛋白進(jìn)行蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)互作分析，分析其分布和功能相關(guān)性。

1.2.6 RT-qPCR驗證AA相關(guān)DEGs的轉(zhuǎn)錄情況：隨機選擇了3個ADEGs(Cyp2b9、Cyp2c39、Gpx8)，內(nèi)參基因為GAPDH，進(jìn)行RT-qPCR。兩樣本分別用RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA。qPCR檢測用熒光定量PCR試劑盒，設(shè)置程序：三步法PCR程序，預(yù)變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 10 s；退火60 ℃ 20 s；延伸72 ℃ 15 s；循環(huán)40次。溶解曲線反應(yīng)程序，72 ℃～95 ℃，升溫2.05 ℃/s，恒定溫度95 ℃持續(xù)15 s；95 ℃～60 ℃，升溫-1.71 ℃/s，恒定溫度60 ℃持續(xù)60 s；60 ℃～95 ℃，升溫0.05 ℃，恒定95 ℃持續(xù)15 s。用2-ΔΔCt計算結(jié)果，驗證其表達(dá)量以及RNA-seq測序結(jié)果。

1.2.7 AA相關(guān)DEGs的AS(選擇性剪切)和SNV(單核苷酸位點變異)/INDEL(插入和缺失)與基因表達(dá)的相關(guān)性分析：利用Excel軟件對兩樣本中ADEGs中出現(xiàn)的頻率倍數(shù)不小于2的AS和SNV/INDEL進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)相關(guān)分析，如果兩樣本間發(fā)生AS和SNV/INDEL頻率倍數(shù)不小于2且0

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

基因表達(dá)以每百萬測序堿基中每千個轉(zhuǎn)錄子測序堿基中所包含的測序片斷數(shù)(expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced，F(xiàn)PKM)比值≥2或≤0.5，且錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)≤0.05的基因為DEGs。使用Excel軟件對ADEGs在兩樣本間發(fā)生頻率數(shù)不小于2的AS和SNV/INDEL與DEGs進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 RNA-seq測序

兩組樣本總RNA送公司測序，分別獲得了5.01G base(35.28M clean reads)和5.02G base(35.32M clean reads)的數(shù)據(jù)。兩樣本所得clean reads數(shù)據(jù)與基因組的匹配率分別為93.65%和89.20%，且兩樣本測序數(shù)據(jù)的Q20皆大于 99%，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

2.2 AA代謝相關(guān)DEGs篩選和功能富集分析

DAVID 6.8搜索AA代謝信號通路相關(guān)基因89個，與測序數(shù)據(jù)比對，共獲得了35個AA代謝相關(guān)DEGs，14個上調(diào)，21個下調(diào)(FPKM≥2或≤0.5, FDR≤0.05)。在腫瘤微環(huán)境到肝癌發(fā)生上調(diào)表達(dá)14個基因分別為Lta4h、Cyp4f18、Ltc4s、Gpx5、Gpx8、Cyp4f18、pla2g5、Cyp2j9、Cyp2c55、Alox15、Ptgs2、Ptg2s3、ptges、Cbr2；下調(diào)表達(dá)基因分別為Cpy2c29、Cpy4a10、Cpy4a12a、Cpy2c38、Cpy2c44、Cpy2c37、Cpy2c70、Cpy2c68、Cpy4f14、Cpy2b9、Cpy2j5、Cpy4a31、Cpy2e1、Cpy4a14、Cpy2c39、Cpy2c54、Cpy2c50、Cpy2j6、Ephx2、Pla2g12b、Cbr1經(jīng)功能富集分析，共得到2個BPs(生物學(xué)程序)，5個CCs(細(xì)胞組分)，9個MFs(分子功能)，1個US(蛋白位點序列特征)和6個KPs(信號通路)(圖1)。

進(jìn)一步對ADEGs富集結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，這35個DEGs中Cyp2c68、Cyp2c29、Cyp4f14、Cyp2b9、Cyp2j5、Cyp4a10、Cyp2c55、Cyp4a14等參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中的IIB，Cyp2c29、Cyp2c68、Cyp2e1、Cyp2c44、Cyp2c39、Cyp2c55、Cyp4f18等參與EPP，其中Cyp2c29、Cyp2c38、Cyp2c55、Cyp2c39、Cyp2c54、Cyp2c37、Cyp2c70、Cyp2c50等一同參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中IIB影響EPP。

2.3 AA相關(guān)DEGs編碼蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析

ADEGs編碼共表達(dá)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)11個DEGs編碼蛋白相關(guān)性較強(圖2)。

圖2 ADEGs編碼蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系Fig 2 Interaction network relationship of ADEGscoding proteins

2.4 AA相關(guān)DEGs的RT-qPCR驗證

隨機選取3個ADEGs進(jìn)行RT-qPCR，內(nèi)參基因為Gapdh。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，其結(jié)果與RNA-seq結(jié)果一致(圖3)。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequence of RT-qPCR

2.5 AA相關(guān)DEGs的AS和SNV/INDEL與基因表達(dá)的相關(guān)性

對ADEGs的可變剪切事件(AS)、單核苷酸變異(SNV)/插入缺失標(biāo)記(INDEL)分析，結(jié)果顯示：均未發(fā)現(xiàn)AS。SNV和INDEL分析則顯示，HCC腫瘤組織中共有21個DEGs發(fā)生了86個SNV和5個INDEL位點的改變。這些基因位點的改變主要發(fā)生在基因的4個部位，即外顯子區(qū)(exonic)、內(nèi)含子區(qū)(intronic)、基因間區(qū)(intergenic)和基因上游區(qū)(upstream)，其中共有13個基因的SNV改變和1個基因的INDEL改變具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)且13個基因的SNV改變和其中1個基因的INDEL改變與其基因的表達(dá)呈正相關(guān)(表2)?；蛭稽c多態(tài)性分析結(jié)果還顯示，有8個ADEGs在HCC腫瘤組織中出現(xiàn)43個SNV和2個INDEL，而癌旁組織中則沒有出現(xiàn)這些SNV/INDEL(表3)。

BP.biological procedure; CC.cell component; MF.molecular function; KP.signaling pathways; US.protein site sequence characteristics

表2 SNV/INDEL與基因表達(dá)的相關(guān)性Table 2 Correlation between SNV/INDEL and gene expression

表3 HCC腫瘤組織中ADEGs的SNV/INDEL的發(fā)生情況Table 3 Occurrence of SNV/INDEL of ADEGs in HCC tumor tissues

3 討論

AA及其代謝產(chǎn)物參與各種組織的炎性反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。對HCC腫瘤及HCC微環(huán)境中AA代謝相關(guān)基因RNA-seq分析顯示，其中有35個DEGs，富集分析DEGs顯示基因功能集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中IIB對EPP的影響。在IIB的21個DEGs中有18個基因在HCC中下調(diào)表達(dá)，3個上調(diào)表達(dá)。EPP的14個DEGs中有12個基因在HCC中下調(diào)表達(dá)，2個上調(diào)表達(dá)。這些基因可與Cbr1、Alox15、Gpx8、Cbr2、Ptgs2一起參與氧化還原過程。這些基因中Cyp2c29、Cyp2b9、Cyp2c70、Cyp2j6等15個也屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)差異基因。以上基因中有22種即Cyp2b9、Cyp2c38、Cyp2c44、Cyp2c70、Cyp2c50、Cyp2j6等，還參與血紅素結(jié)合，這些基因大部分都下調(diào)表達(dá)，表明從HCC的癌旁組織到腫瘤發(fā)生過程中，參與血紅素結(jié)合的蛋白質(zhì)組分可能表達(dá)量減少，又由于血紅素是環(huán)氧化酶P450的活性中心，從而使其與正常的環(huán)氧化酶P450功能有差異。

GO分析結(jié)果還表明，這些基因中的17種：Cyp2c29、Cyp2b9、Cyp2c38、Cyp2c44、Cyp2c70、Cyp2c50、Cyp2j6等還參與花生四烯酸環(huán)氧酶活性。KP分析表明，AA代謝相關(guān)差異表達(dá)基因也參與以上 GO功能相關(guān)的6個信號通路，還參與GO相關(guān)的1個蛋白位點序列特征。這些結(jié)果表明，在 HCC中，大量AA相關(guān)的DEGs異常表達(dá)主要集中在EPP。而且，IIB的異常在改變EPP中發(fā)揮著極其重要的作用。蛋白互作分析也說明了這些基因功能的相關(guān)性。

SNV/INDEL結(jié)果表明，SNV/INDEL引起的基因多態(tài)性在 HCC中扮演著調(diào)控基因表達(dá)的重要功能。另外，研究結(jié)果還顯示，HCC 中下調(diào)及上調(diào)表達(dá)在ADEGs的IIB相關(guān)DEGs中多具有SNV現(xiàn)象，這些基因突變后則會影響EPP功能。

綜上所述，在HCC中共獲得了35個ADEGs。功能主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中IIB對EPP的影響。在ADEGs中IIB相關(guān)的DEGs涉及的許多相關(guān)基因都有廣泛的 SNV 現(xiàn)象，因此提示，IIB在 HCC 微環(huán)境的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中可通過自身的基因多態(tài)性突變引起EPP異常對AA代謝產(chǎn)生影響實現(xiàn)腫瘤的發(fā)生，在癌細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮重要作用，SNV 可能是一些基因上調(diào)及下調(diào)表達(dá)的重要調(diào)控因素。