饒金鵬，邱 楓，蔡益婷，魏 凱，金 敏，金 帆

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1.附屬第二醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心； 2.附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院 生殖遺傳教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 杭州 310000)

篩選獲得高質(zhì)量精子是輔助生殖(assist reproductive technology, ART)體外受精成功的關(guān)鍵之一，密度梯度離心(density gradient centrifugation, DGC)或上游(swim-up, SU)因操作簡(jiǎn)單，并能在較短時(shí)間內(nèi)將活力較好的精子從精漿、死精、白細(xì)胞、病原微生物等有害物質(zhì)中分離出來(lái)，而成為廣大生殖醫(yī)學(xué)中心采用的主流方法。已有研究顯示DGC及SU處理后的運(yùn)動(dòng)精子在DNA完整性、細(xì)胞膜成熟度或細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上存在一定比例的缺陷[1]，這可能影響ART的受精率，增加缺陷精子與卵子結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)。

人體內(nèi)受精是一個(gè)自然選擇的過(guò)程。精子需從陰道開始，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)距離的游動(dòng)，先后經(jīng)過(guò)宮頸、子宮和輸卵管，而當(dāng)精子游至輸卵管時(shí)，由于管腔內(nèi)溫度梯度的存在，使得具有熱趨向性的獲能精子定向游到壺腹部與卵子結(jié)合[2-3]。但目前絕大多數(shù)生殖醫(yī)學(xué)中心在使用DGC或SU處理完精液后，未對(duì)精子進(jìn)行進(jìn)一步的長(zhǎng)距離篩選，而將溫度趨向性機(jī)制引入ART的報(bào)道也僅見(jiàn)于哺乳動(dòng)物[4-5]。本研究通過(guò)增加獲能精子的水平游動(dòng)距離，并設(shè)置溫度梯度，分析不同距離、溫度條件下精子活力、濃度、正常形態(tài)率及DNA碎片率等指標(biāo)的變化，探討適宜的距離-溫度條件組合(distance-temperature-combined selection conditions)，為進(jìn)一步改善ART中優(yōu)質(zhì)授精精子的制備提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：40%和80%梯度離心培養(yǎng)液(SAGE公司)；精子洗滌液Sperm Rinse、配子處理液G-GAMETE、石蠟培養(yǎng)油(Vitrolife公司)；人血清白蛋白(Irvine公司)；Diff-Quik精子快速染色試劑盒、精子DNA碎片檢測(cè)試劑盒(深圳博銳德生物科技有限公司)；甲醇、乙醇(杭州雙林化工試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 精液樣本：選取2019年1月至2019年9月于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院男科行精液常規(guī)檢查正常的精液樣本20份(均保證取精前禁欲2～7 d)。保留部分精液原液(O組)后，將余下精液小心加到含有80%和40%密度梯度離心液的管中，300×g離心15 min，收集底部沉淀并重懸于5 mL精子洗滌液中200×g離心10 min，再用5 mL精子洗液重復(fù)洗滌一遍后將精子沉淀重懸于0.5 mL的體外配子處理液G-GAMETE中，即得到去除了精漿、白細(xì)胞等雜質(zhì)的獲能精子。樣本取材經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)(倫理審批編號(hào)：研2019-209)，患者知情并同意將樣本用于科學(xué)研究。

1.2.2 距離-溫度聯(lián)合篩選精子：選取直徑為100 mm的培養(yǎng)皿，用記號(hào)筆在圓皿外底面標(biāo)記不同長(zhǎng)度(2、5和8 cm)的刻度線，再用加樣器吸取恒定液體量(500 μL)的G-GAMETE培養(yǎng)液并沿背面刻度線加注并拉出寬度相同的條狀液滴，最后在液滴表面覆蓋石蠟油。將恒溫培養(yǎng)箱溫度分別設(shè)置為32 ℃和37 ℃，將裝有條狀液滴的培養(yǎng)皿分別放入不同溫度的培養(yǎng)箱內(nèi)。其中，32 ℃培養(yǎng)箱中部分培養(yǎng)皿底部一側(cè)墊有37 ℃恒溫電熱片，保證皿內(nèi)3條液滴的右側(cè)對(duì)齊并位于電熱片導(dǎo)熱區(qū)的正上方，同時(shí)使用微滴溫度檢測(cè)儀對(duì)培養(yǎng)皿中條狀液滴的不同區(qū)段進(jìn)行溫度測(cè)定，以驗(yàn)證形成32 ℃～37 ℃的溫度梯度(圖1)。培養(yǎng)液均需在箱中平衡4 h以上，從而形成A1(2 cm,32 ℃)、A2(5 cm,32 ℃)、A3(8 cm,32 ℃)、B1(2 cm,37 ℃)、B2(5 cm,37 ℃)、B3(8 cm,37 ℃)、C1(2 cm,32 ℃～37 ℃)、C2(5 cm,32 ℃～37 ℃)、C3(8 cm,32 ℃～37 ℃)9組不同的距離-溫度聯(lián)合篩選條件。將離心后的獲能精子分成體積相等(50 μL)的10份,留存1份作為初始樣本I組(0 cm,37 ℃)，其余9份添加到各條狀液滴的一端，孵育60 min后，從液滴的另一端收集精子樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

The right side of three strip droplets are aligned and placed on the heating plate forming a temperature gradient圖1 距離-溫度聯(lián)合篩選法Fig 1 Distance-temperature-combined spermselection approach

1.2.3 精子濃度、活力的測(cè)定：充分混勻精液標(biāo)本，取標(biāo)準(zhǔn)體積的精液置于改良Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，當(dāng)相差顯微鏡視野中精液不再漂浮，計(jì)數(shù)并計(jì)算精子濃度[6]。對(duì)樣本進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助精子分析(computer-aided sperm analysis，CASA)，通過(guò)前向運(yùn)動(dòng)(progressive motility, PR)、非前向運(yùn)動(dòng)(non-progressive motility, NP)及不動(dòng)(immobility, IM)精子數(shù)據(jù)的讀取，評(píng)估精子的活力[6]。

1.2.4 精子形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)：采用Diff-Quik快速染色法評(píng)估精子選擇對(duì)形態(tài)學(xué)的影響。將10 μL精子樣本均勻涂布于潔凈的載玻片上，空氣中自然干燥后，使用固定劑(三芳基甲烷)、染液A(嗜酸性氧雜蒽)、染液B(嗜堿性硫氮雜苯)對(duì)玻片染色，流水浸洗除去多余染劑，干燥后于100×油鏡下觀察染色精子，判斷并計(jì)數(shù)正常形態(tài)精子所占的比例[6]。

1.2.5 精子DNA損傷檢測(cè)：采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)(sperm chromatin dispersion assay, SCD)來(lái)判斷精子優(yōu)選的效果[6-7]。使用深圳博銳德精子DNA碎片檢測(cè)試劑盒，取定量精子樣本加入到預(yù)先

裝于Eppendorf管中的呈融化狀態(tài)的瓊脂糖凝膠中，混合后取30 μL制作涂片，并于4 ℃冰箱中靜置5 min， 使精子包埋于瓊脂糖微凝膠，將涂片浸入酸性反應(yīng)液A(7 min)和反應(yīng)液B(25 min)，再經(jīng)過(guò)蒸餾水和乙醇洗脫，使精子發(fā)生酸變性并去除核蛋白，最后再經(jīng)過(guò)瑞氏染色后于200×鏡下觀察精子雙鏈DNA擴(kuò)散形成特征性光暈的情況，光暈寬度≤精子頭部最小直徑的1/3視為碎片化精子，最后計(jì)算DNA損傷精子百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 精子濃度的比較

在溫度條件相同情況下孵育60 min，精子的濃度隨著水平游動(dòng)距離的延長(zhǎng)呈極顯著下降(P<0.01)。在距離相同的條件下，32 ℃～37 ℃溫度梯度中精子的濃度顯著性高于恒溫32 ℃或恒溫37 ℃中精子的濃度(P<0.01)，恒溫32 ℃與恒溫37 ℃中精子濃度無(wú)明顯差異(表1)。

表1 不同距離-溫度聯(lián)合篩選條件下精子濃度的比較Table 1 Comparison of sperm concentration by different distance-temperature-combined selection n=20)

2.2 精子活力的比較

在進(jìn)行距離-溫度聯(lián)合篩選之前，使用密度梯度離心法處理后得到的獲能精子，其活動(dòng)精子百分率(PR+NP)顯著性高于精液原液的活動(dòng)精子百分率(P<0.01)。32 ℃、37 ℃、32 ℃～37 ℃條件下，隨著距離的延長(zhǎng)，精子活力無(wú)明顯提高(圖2)。

O.original sperm sample before DGC; I.initial capacitated sperm after DGC; A1～C3.sperm samples processed by different distance-temperature selection conditions; *P<0.01 compared with group O圖2 不同距離-溫度聯(lián)合篩選條件下精子活力的比較Fig 2 Comparison of sperm motility by differentdistance- temperature-combined selection

2.3 精子形態(tài)正常率的比較

精子采用Diff-Quik法進(jìn)行染色并判斷其形態(tài)是否正常(圖3A)。在進(jìn)行距離-溫度聯(lián)合篩選之前，使用密度梯度離心法處理后得到的獲能精子，其正常形態(tài)率與精液原液的正常形態(tài)率相比無(wú)明顯差異。在溫度條件相同情況下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)距離(5、8 cm)篩選獲得的精子比初始的獲能精子(0 cm)具有更高的正常形態(tài)率(P<0.05)。在距離相同的條件下，32 ℃～37 ℃溫度梯度中精子的正常形態(tài)率略高于恒溫32 ℃或恒溫37 ℃中精子的正常形態(tài)率，但差異不明顯(圖3B)。

A.part of sperm morphology(×1 000); 1.normal; 2～8. abnormal; B.the percentage of sperm with normal morphology after different treatments; O.original sperm sample before DGC; I.initial capacitated sperm after DGC; A1～C3.sperm samples processed by different distance-temperature selection conditions; *P<0.05 compared with group I

2.4 精子DNA碎片率的比較

經(jīng)SCD法檢測(cè)后含有DNA碎片的精子或DNA完整的精子(圖4A)。距離-溫度聯(lián)合篩選前，密度梯度離心法處理后得到的獲能精子，其DNA碎片率與精液原液的DNA碎片率相比無(wú)明顯差異。恒溫條件下，長(zhǎng)距離(5、8 cm)篩選獲得的精子，其DNA碎片率略低于短距離(2 cm)以及初始獲能精子。長(zhǎng)距離(5、8 cm)聯(lián)合32 ℃～37 ℃溫度梯度，其DNA碎片率較初始獲能精子進(jìn)一步降低(P<0.05，圖4B)。

A.effect of sperm chromatin dispersion assay(×200); sperm with integrated DNA (yellow arrows) and sperm with DNA fragmentation (blue arrow); B.the percentage of sperm with DNA fragmentation after different treatments; O.original sperm sample before DGC; I.initial capacitated sperm after DGC; A1～C3.sperm samples processed by different distance-temperature selection conditions; *P<0.05 compared with group I

3 討論

本研究基于女性生殖道距離較長(zhǎng)以及存在溫度梯度的特性，設(shè)置不同的距離、溫度條件對(duì)具有更好前向運(yùn)動(dòng)性及溫度趨向性的精子進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)距離(5、8 cm)的水平游動(dòng)，精子的正常形態(tài)率顯著高于初始獲能精子以及精液原液的正常形態(tài)率，原因可能在于較長(zhǎng)的距離設(shè)置更接近女性生殖道的生理長(zhǎng)度，從而篩選得到更高比例具有正常遷移能力的精子[8]。短距離(2 cm)條件對(duì)檢驗(yàn)精子遷移能力相對(duì)有限，且隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，一部分低質(zhì)量精子會(huì)借助液體的擴(kuò)散作用移動(dòng)到臨近的收集區(qū)域， 故篩選效果不明顯。上游法由于加入到精液上方的培養(yǎng)基體積較小[9]，使精子游動(dòng)的距離同樣較短，且在吸取上清的過(guò)程中存在將底部沉淀一同吸起的風(fēng)險(xiǎn)，因此其效果也不如長(zhǎng)距離篩選。

本研究將溫度梯度設(shè)為32 ℃～37 ℃，不同于以往文獻(xiàn)報(bào)道的溫度梯度設(shè)置[10-11]。原因在于本研究的目的是將篩選獲得的精子用于人的體外受精，41 ℃[10]或39 ℃[11]的溫度上限設(shè)置超出了人體正常的生理溫度，而高溫會(huì)導(dǎo)致精子DNA、線粒體或細(xì)胞膜的損傷[12]。前期的研究顯示，只有獲能的精子具有改變其原有運(yùn)動(dòng)方向并朝著溫度更高區(qū)域游動(dòng)的能力[2-3]。因此，本研究在使用溫度梯度篩選精子前首先使用密度梯度離心使精子獲能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無(wú)論在2、5還是8 cm的條件下，32 ℃～37 ℃溫度梯度中精子的濃度都顯著高于恒溫32 ℃或恒溫37 ℃中精子的濃度，證實(shí)了人精子具有溫度趨向性，這與用熱分隔管獲得的結(jié)果相一致。此外，在長(zhǎng)距離(5和8 cm)條件下， 32 ℃～37 ℃的溫度梯度使得所獲得精子的DNA碎片率顯著低于初始獲能精子的DNA碎片率。這可能是由于能夠沿著溫度梯度游過(guò)較長(zhǎng)距離的精子，其內(nèi)部由磷脂酶C和肌醇三磷酸受體Ca2+通道介導(dǎo)的溫度趨向性機(jī)制能正常運(yùn)作[3]，而正常運(yùn)作的前提是需要精子細(xì)胞具有較好的DNA完整性。

隨著距離的延長(zhǎng)或溫度梯度的增設(shè)，精子的活力未見(jiàn)顯著性提高，這應(yīng)該是由于傳統(tǒng)的密度梯度離心法在篩選獲得高活力精子方面效果明顯，使得活力進(jìn)一步提升的空間受限。但隨著距離的延長(zhǎng)，精子的濃度呈極顯著下降趨勢(shì)，這與精子體內(nèi)受精的情況相一致[13]。而即使增設(shè)了溫度梯度條件，在有限時(shí)間內(nèi)經(jīng)過(guò)8 cm的水平距離游動(dòng)，所獲得的精子密度也是極低的(0.6×105個(gè)/mL)，難以達(dá)到正常體外受精所需精子量的下限值(1.5×105個(gè)/mL)[9,14]。而(5 cm，32 ℃～37 ℃)條件下所獲得精子的活力、正常形態(tài)率、DNA碎片率與(8 cm，32 ℃～37 ℃)條件下相當(dāng)，但精子密度更高(8×106個(gè)/mL)，能夠達(dá)到實(shí)施體外受精精子濃度的標(biāo)準(zhǔn)。因此，認(rèn)為(5 cm，32 ℃～37 ℃)條件下優(yōu)選獲得的精子，可能更適宜應(yīng)用于今后體外受精的臨床實(shí)踐。較低的精子正常形態(tài)率與體外受精后較低的持續(xù)妊娠率呈顯著性相關(guān)，而精子DNA碎片率過(guò)高也會(huì)導(dǎo)致受精失敗、早期流產(chǎn)、新生兒缺陷等不良ART結(jié)局[15]。距離-溫度聯(lián)合的新型篩選法比傳統(tǒng)精液體外處理法能夠獲得正常形態(tài)率更高，DNA碎片率更低的精子，可降低體外受精過(guò)程中缺陷精子與卵子發(fā)生結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)，相信該方法的應(yīng)用能夠使廣大不孕癥患者獲益。