熊瑋 曾玉蘭 周薇

有研究表明,COPD早期階段病人和沒有氣流受限的吸煙者均可發(fā)生肺血管改變[1]。肺血管重塑過程分子機制復雜，其中TGF-β1在血管張力和增殖的控制上扮演著重要角色[2]。Th17細胞是一種擁有獨立分化機制的新型 CD4+效應 T 細胞，在COPD、哮喘等慢性炎癥性疾病和多種自身免疫性疾病中均有重要作用。IL-17是 Th17 細胞的主要效應因子。已有研究證明，低壓低氧可致Th17細胞在肺組織中增多，在肺血管與心肌結構重塑中發(fā)揮重要作用[3]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)和IL-6共同作用，誘導了Th17細胞的分化。Smads蛋白家族參與TGF-β1的細胞內信號轉導，其中Smad2/3是TGF-β通路信號下傳的第一個信號分子。本研究通過建立香煙煙霧暴露大鼠模型進行觀察，并進一步加入藥物干預，以期探討IL-17、TGF-β1及TGF-β/Smad通路在肺血管重塑中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級健康雄性 7周齡SD大鼠72只，體質量(210±10)g(由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院老年醫(yī)學研究所動物實驗室飼養(yǎng));CY-100B 數字測氧儀，兔抗 TLR-4 多克隆抗體、小鼠抗PCNA 單克隆抗體、PV600免疫試劑盒(武漢谷歌生物公司);奧林巴斯光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司);HMIAS-2000 彩色圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影像公司)。

1.2 實驗模型制備及動物分組 參照文獻[4]制備大鼠被動吸煙裝置，煙熏箱大小為 100 cm×65 cm×45 cm，每側各留9個直徑2.5 cm的通氣孔。大鼠適應性喂養(yǎng)7 d無異常后隨機分為對照組(S1組)、煙霧暴露組(S2組)、煙霧暴露+藥物干預組(S3組)，每組各 24只。S1組大鼠置于小鐵籠內，自由呼吸空氣，除常規(guī)喂養(yǎng)外不做其他處理；S2、S3組大鼠在規(guī)定煙霧暴露時間內放置于煙熏箱內，每次使用10支香煙捆扎為一組后點燃并置于煙熏箱中的支架上，香煙采用武漢市售紅金龍牌香煙，每支焦油含量為15 mg。用 CY-100B數字測氧儀進行監(jiān)測，煙熏箱中的氧濃度保持在 20%～21%之間，根據監(jiān)測結果開放煙熏箱的通氣孔；大鼠每天煙霧暴露2次，每次30 min，2次暴露時間間隔4 h。香煙煙霧暴露間隔期間將大鼠置于正常無煙環(huán)境中飼養(yǎng)，任其自由活動、飲食。同時，S3組大鼠于第5周起每次煙熏后腹腔注射Smad3抑制劑SB431542，2次/d，直至第12周。Smad3抑制劑(SB431542)以二甲基亞砜(DMSO)溶解，使用前將SB431542溶解在2%DMSO+30%聚乙二醇300+雙蒸水中，濃度為5 mg/mL，每次使用劑量為5 mg/kg，2次/d。如出現(xiàn)死亡則終止實驗。S1、S2、S3組分別于第8周、第12周隨機處死12只大鼠。

1.3 病理標本制作 各組大鼠到達造模時間干預點后，用1%戊巴比妥鈉(90 mg/kg)進行麻醉，眼球取血法取血，制備血清。放血處死后開胸，分離出肺臟，取左肺用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，行石蠟包埋，病理切片機切片，切片厚度約4μm。

1.4 肺血管蘇木精-伊紅(HE)染色及病理學觀察 病理切片用HE染色法染色，在光學顯微鏡下觀察各組大鼠肺泡和肺血管的病理學情況，每張切片隨機選取結構較完整、橫斷面較圓且直徑約為50～200μm 的肺動脈 5 支，分別測量內外徑、血管面積及管壁厚度，以圖文分析儀測量并記錄管壁面積/血管總面積(vascular wall area/total vascular area，WA%)和血管壁厚度/血管外徑(vascularwall thickness/vascular external diameter，WT%)。

1.5 IL-17檢測 采用免疫組化法檢測大鼠肺組織中IL-17表達水平，ELISA法測定血清中 IL-17 的含量。IL-17免疫組化試劑盒均由美國 Santa Cruz 公司生產。IL-17一抗為山羊抗大鼠 IL-17 單克隆抗體，1∶70稀釋。陰性對照均用PBS代替。染色步驟按說明書進行。以顯微鏡400倍視野下，隨機5個視野陽性染色積分光密度(IOD)均值反映IL-17表達量。

1.6 Smad3檢測 采用免疫組化法檢測肺組織中Smad3的表達水平，用鏈霉親和素過氧化物酶 (SP)法進行。微波加熱法修復抗原，DAB顯色。試劑盒購自博士德生物制品有限公司，Smad3抗體濃度為1∶200。以5個視野IOD均值反映Smad3表達量。

1.7 TGF-β1檢測 采用PV6000二步法免疫組化染色法檢測肺動脈組織TGF-β1的表達水平，按照試劑盒說明書進行操作，每張切片在 400 倍視野下隨機采集5條直徑100～200μm的動脈，采集圖像，測定每個視野下陽性染色動脈的吸光度(A)，進行定量分析。

2 結果

2.1 動物的一般情況 實驗開始前，各組動物活動、飲食情況良好，活動敏捷。在整個實驗過程中未見死亡小鼠。實驗動物每日給予充足定量飼料，觀察每日飼料剩余量。與S1組比較，8 周及12周時，S2動物活動度明顯下降，反應遲鈍、飲食量下降；S3組活動度下降，反應遲鈍，飲食量下降，但較S2組程度減輕。

2.2 HE染色觀察肺組織的病理形態(tài)學改變 對照組肺動脈壁較薄，結構正常。S2組及S3組隨煙霧暴露時間延長，氣道和血管周圍炎性細胞浸潤逐漸加重，肺血管壁逐漸增厚。但未見肺氣腫改變。見圖1。

肺血管重塑定量分析觀察指標：S1組8周與12周的WA%和WT%值無明顯差異。S2組8周和12周的WT%、WA%值均較同期S1組顯著增加，S2組12周時肺動脈壁厚度明顯大于8周時，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。S3組8周及12周時的WA%和 WT%值分別高于同期S1組，但低于同期S2組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

A：S1組8周時；B：S1組12周時；C：S2組8周時；D：S2組12周時；E：S3組8周時；F：S3組12周時 圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學改變(HE染色，×200)

2.3 各組小鼠肺動脈組織TGF-β1的表達水平比較 S1組8周及12周時肺動脈無 TGF-β1 陽性染色，S2組8周及12周時肺動脈平滑肌細胞胞漿 TGF-β1強陽性染色。S3組8周及12周時肺動脈平滑肌細胞胞漿 TGF-β1強陽性染色。見圖2。S2組8周、12周時，TGF-β1蛋白相對表達量均較同期S1組顯著增加(P<0.05)，且12周時明顯高于8周亞組(P<0.05)。S3組8周及12周時TGF-β1蛋白相對表達亦明顯高于同期S1組(P<0.05)，但與同期S2組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.4 肺組織IL-17、Smad3表達水平比較 S2組肺組織IL-17、Smad3表達水平隨煙霧暴露時間延長而增加，且較同期S1組增加，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。S3組8周及12周時，肺組織IL-17、Smad3表達較同期S2組減少，但較同期S1組增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

A：S1組8周時；B：S1組12周時；C：S2組8周時；D：S2組12周時；E：S3組8周時；F：S3組12周時 圖2 免疫組化法檢測肺動脈組織TGF-β1的表達水平(DAB 顯色，×200)

2.5 血清中 IL-17 的水平比較 S2組血清IL-17水平隨煙霧暴露時間延長表達增加，且較同期S1組增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。S3組8周及12周時，血清IL-17水平高于同期S1組(P<0.05)，但低于同期S2組(P<0.05)。見表1。

表1 各組肺血管重塑指標及免疫組化檢測指標比較

2.6 TGF-β1與WA%、WT%及肺組織IL-17、Smad3的相關性分析 肺動脈中TGF-β1表達水平與WA%、WT%(r=0.797、0.901，P<0.01)以及肺組織IL-17、Smad3(r=0.479、0.891，P<0.01)表達水平均呈正相關。

3 討論

肺血管重塑是肺動脈內膜、中膜和外膜共同增厚的過程。香煙煙霧可以直接作用于肺血管，在未發(fā)生缺氧、肺功能下降和肺血管床損毀的情況下，即可引起肺血管重塑，但具體機制尚不完全明確。

龍翔等[5]研究發(fā)現(xiàn)，吸煙的COPD病人及吸煙的肺功能正常人群肺組織中的IL-17信使RNA 的相對表達量及 IL-17細胞因子均較未吸煙者增高。在對低壓低氧復制缺氧性肺動脈高壓(PAH)大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，低壓低氧后，大鼠肺組織及血清中IL-17表達水平增高，分析認為低壓低氧后，Th17細胞在肺組織中增多，導致肺組織 IL-17水平增高，IL-17可以刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞表達內皮細胞黏附分子1等黏附分子，并能增強血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等生長因子的促增殖作用，共同參與肺血管重塑[3]。IL-17能募集及活化中性粒細胞，促進T細胞活化及刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生細胞因子，從而介導組織炎癥反應，促進新生血管的生成[6]。IL-17是 Th17 細胞的主要效應因子。Th17細胞的分化需要TGF-β信號的參與。

TGF-β1具有重要的免疫調節(jié)和致纖維化活性，故而在氣道炎癥及氣道重塑中占重要地位[7]。其存在于所有的哺乳動物中，上皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、單核細胞、巨噬細胞等細胞都能夠合成并釋放TGF-β1。研究表明，在炎癥反應明顯的COPD大鼠中,其肺小動脈的內皮細胞和平滑肌細胞TGF-β1表達增高[2]。吸煙也可以導致大鼠氣道上皮細胞 TGF-β1表達明顯升高，而且香煙煙霧刺激時間越長，TGF-β1表達越多[8]。

本實驗通過建立煙霧暴露大鼠肺血管重塑模型，經HE染色觀察到煙霧暴露后各組大鼠肺血管都發(fā)生了不同程度的炎癥浸潤及管壁變形、增厚，管腔狹窄等，其中以吸煙 12周的小鼠血管的改變最為明顯。通過計算血管重塑的客觀指標(WA%和WT%)，證實肺血管重塑隨煙霧暴露時間延長而逐漸加重，肺血管重塑程度與煙霧暴露時間呈正比。而隨煙霧暴露時間延長，大鼠肺組織及血清中IL-17表達亦增高，肺組織中Smad3表達增加，與肺動脈組織中TGF-β1表達呈正相關；肺動脈組織中TGF-β1表達增高，與肺血管重塑水平呈正相關。表明IL-17、Smad3、TGF-β1在肺血管重塑中起重要作用。在一項對COPD病人的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，COPD病人的血清、肺泡灌洗液中IL-17的含量均明顯增高，表明IL-17可能在COPD的病理進程中發(fā)揮重要的作用[9]。加入Smad3抑制劑進行干預后，肺血管組織中TGF-β1未明顯減少，但血清IL-17及肺組織中IL-17明顯減少，肺血管重塑程度較同期S2組減輕，表明在IL-17、TGF-β1參與的肺血管重塑過程中，TGF-β/Smad3通路起重要作用。

TGF-β發(fā)揮生物學效應主要依賴于其下游高度保守的胞內信號蛋白-Smads蛋白家族介導的信號傳遞,TGF-β通過激活其受體的Smad2和Smad3，聯(lián)合核轉錄因子來調控基因轉錄。作為TGF-β1的下游信號，Smad3是參與 COPD發(fā)病的關鍵性細胞因子。野百合堿PAH模型大鼠肺動脈中，TGF-β1、磷酸化Smad3 蛋白表達明顯升高，Smad3 磷酸化水平顯著增高，證實在PAH大鼠肺動脈中TGF-β/Smad3信號通路呈顯著活化狀態(tài)，參與大鼠PAH的發(fā)生發(fā)展過程[10]。SB431542為特異性ALK5抑制劑，即TGF-β受體Ⅰ的抑制劑，可以抑制ALK5激活對下游信號分子Smad2/3的磷酸化，從而阻斷依賴Smad 途徑。本次實驗表明，使用SB431542能減少IL-17表達，減輕肺血管重塑程度。但肺血管重塑發(fā)病機制復雜，可能有多種信號通路參與其中，Smad信號通路是其中途徑之一。在肺纖維化發(fā)病機制中，TGF-β1 還可能誘導非Smad信號通路。

綜上所述，煙霧暴露大鼠肺組織中IL-17、肺血管組織中TGF-β1表達明顯增高，通過多種途徑參與肺血管重塑過程，其中Smad3在促進IL-17表達及肺血管重塑中起重要作用，SB431542通過阻斷TGF-β/Smad通路可能減輕肺血管重塑程度，可能為今后COPD、肺血管疾病的治療提供方向。但本研究未對SB431542的使用劑量進一步探討，使用抑制劑的不良反應需長期觀察。而且IL-17參與肺血管重塑可能存在多種途徑，仍需進一步研究。