湯明杰，顏識涵，張明焜，魏東山, 杜春雷*，崔洪亮

1. 中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院，重慶市跨尺度制造重點實驗室，重慶 400714 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

引 言

基因是攜帶了遺傳信息的DNA或RNA序列，是控制生物性狀的基本遺傳單位。堿基是核酸分子(包括DNA和RNA)的重要組成部分，此外，核酸中還有一些含量較少的稀有堿基，大部分是堿基的甲基衍生物。堿基是核酸信息存儲和傳遞的基礎(chǔ)，是生物遺傳、 進化和變異的根本原因，所以研究核酸分子堿基對研究生物活性和生物行為具有重要意義[1-5]。因此，研究核酸分子堿基的光譜特征對于表征核酸分子結(jié)構(gòu)的改變和核酸分子與小分子的相互作用提供參考價值。

太赫茲(THz)輻射介于微波和紅外之間，頻率范圍大概在0.1～10 THz。雖然有些太赫茲輻射會影響DNA的動態(tài)過程，進而影響DNA的復(fù)制和基因表達[6-7]，甚至高強度的太赫茲脈沖會造成DNA損傷[8]，但是輻射強度低的太赫茲并不會影響DNA分子的結(jié)構(gòu)和功能[9-10]。近年來，太赫茲時域光譜技術(shù)(Terahertz time-domain spectroscopy，THz-TDS)已被廣泛應(yīng)用于化學(xué)檢測、 材料鑒定和生物醫(yī)學(xué)[11-13]。太赫茲光譜對分子間氫鍵的相互作用非常敏感，許多低頻的振動模式(例如骨架振動)位于THz波段。

采用THz-TDS檢測了DNA、 RNA堿基(胞嘧啶(C)、 鳥嘌呤(G)、 腺嘌呤(A)、 胸腺嘧啶(T，DNA專有)和尿嘧啶(U，RNA專有)和稀有堿基[5-甲基胞嘧啶(m5C)、 1-甲基腺嘌呤(m1A)]的太赫茲光譜，同時與拉曼光譜技術(shù)對7種堿基的檢測能力作了對比，探討了兩種光譜技術(shù)檢測7種核酸堿基的可行性。

1 實驗部分

1.1 樣品制備

7種核酸堿基的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。制備每種堿基樣品時，先稱取0.12 g左右粉末放入直徑為13 mm的壓片磨具內(nèi)，輕微震蕩使其分布均勻，使用壓片機在2 MPa的壓力下做成厚度為0.6～0.9 mm的圓盤狀薄片進行太赫茲時域光譜和拉曼光譜實驗。實驗中采用了一個自行設(shè)計的樣品夾具將樣品夾在帶有小孔的兩個靠磁性吸附在一起的薄片之間，樣品尺寸略大于小孔(如圖2所示)。

圖1 7種核酸堿基的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 7 Molecular structural formulas of nucleic acid bases

圖2 自制樣品夾具示意圖1: 夾具底座; 2: 帶孔鐵片; 3: 樣品片; 4: 帶孔的橡膠磁薄片F(xiàn)ig.2 The schematic diagram of self-made sample fixture1: Fixture base; 2: Iron sheet with holes;3: Sample sheet; 4: Rubber sheet with holes

1.2 堿基的太赫茲時域光譜檢測

采用T-Ray 5000 THz-TDS系統(tǒng)(Advanced Photonix Inc.，美國)。實驗在室溫(約294 K)下進行，為了避免空氣中水分對THz波的影響，實驗裝置放在充有氮氣的密封箱內(nèi)，保證樣品在測量時的濕度被控制在3%左右。在分析堿基的太赫茲時域光譜時，首先對太赫茲時域光譜進行傅里葉變換求取頻域光譜，然后根據(jù)如下物理模型求取樣品的吸收系數(shù)

其中，n為樣品折射率，φ(ω)為樣品信號和參考信號的相位差，ω為角頻率，d為樣品的厚度，a為樣品吸收系數(shù)，ρ(ω)為樣品信號和參考信號的振幅之比。

1.3 堿基的拉曼光譜檢測

測試樣品拉曼光譜所采用的設(shè)備為英國Renishaw inVia Reflex拉曼光譜儀，直接對粉末進行測量。選用532 nm激光器。實驗時，首先用潔凈的硅片進行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)硅片的拉曼峰值位置在520 cm-1。在分析堿基的拉曼光譜時，將得到的堿基拉曼光譜分別進行基線校準(zhǔn)，平滑和歸一化處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿基的太赫茲時域光譜分析

圖3為DNA和RNA堿基(胞嘧啶(C)、 鳥嘌呤(G)、 腺嘌呤(A)、 胸腺嘧啶(T，DNA專有)和尿嘧啶(U，RNA專有)和稀有堿基[5-甲基胞嘧啶(m5C)、 1-甲基腺嘌呤(m1A)]和背景樣品池的太赫茲時域光譜。圖4為DNA、 RNA堿基(胞嘧啶(C)、 鳥嘌呤(G)、 腺嘌呤(A)、 胸腺嘧啶(T，DNA專有)和尿嘧啶(U，RNA專有)和稀有堿基(5-甲基胞嘧啶(m5C)、 1-甲基腺嘌呤(m1A)在0.2～2.0 THz的太赫茲吸收譜。從圖中可以看出，DNA的4種堿基差異明顯，只有G沒有明顯吸收峰，A有兩個吸收峰，T和C各有一個吸收峰，峰位不同；RNA的4種堿基差異也很明顯，G沒有明顯吸收峰，A有兩個吸收峰，U和C各有一個吸收峰，峰位不同；堿基C和稀有堿基m5C也有很大差異，稀有堿基m5C沒有明顯的特征峰，但吸收系數(shù)較高，隨著頻率的增加，m5C吸收譜線緩慢上升；堿基A和稀有堿基m1A也有很大差異，稀有堿基m1A有一個較為明顯的特征峰，且吸收系數(shù)明顯高于其他6種堿基；7種堿基在太赫茲特征峰和吸收強度上差異顯著。表1列出了7種核酸堿基的太赫茲特征吸收峰。

圖3 DNA、 RNA堿基(胞嘧啶(C)、 鳥嘌呤(G)、 腺嘌呤(A)、 胸腺嘧啶(T，DNA專有)和尿嘧啶(U，RNA專有)和稀有堿基[5-甲基胞嘧啶(m5C)、 1-甲基腺嘌呤(m1A)]和背景樣品池的太赫茲時域光譜Fig.3 THz time-domain spectra of DNA, RNA bases (cytosine (C), guanine (G), adenine (A), thymine (T, DNA-specific) and uracil (U, RNA-specific) and rare bases (5-methylcytosine (m5C), 1-methyladenine (m1A) and background sample cell

圖4 DNA、 RNA堿基(胞嘧啶(C)、 鳥嘌呤(G)、 腺嘌呤(A)、 胸腺嘧啶(T，DNA專有)和尿嘧啶(U，RNA專有)和稀有堿基(5-甲基胞嘧啶(m5C)、 1-甲基腺嘌呤(m1A))在0.2～2.0 THz的太赫茲吸收譜Fig.4 Terahertz absorption spectra of DNA, RNA bases (cytosine (C), guanine (G), adenine (A), thymine (T, DNA-specific) and uracil (U, RNA-specific) and rare bases (5-methylcytosine (m5C), 1-methyladenine (m1A)) at 0.2 to 2.0 THz

表1 7種核酸堿基的太赫茲特征吸收峰 (THz)Table 1 Terahertz characteristic absorption peaks of 7 nucleic acid bases (THz)

2.2 堿基的拉曼光譜分析

圖5為DNA、 RNA堿基(胞嘧啶(C)、 鳥嘌呤(G)、 腺嘌呤(A)、 胸腺嘧啶(T，DNA專有)和尿嘧啶(U，RNA專有)和稀有堿基(5-甲基胞嘧啶(m5C)、 1-甲基腺嘌呤(m1A)在600～1 750 cm-1的拉曼光譜。從圖5可以看出，7種堿基也表現(xiàn)出很多明顯的不同的拉曼譜峰，但其特征峰雜而多，較難直觀識別。

圖5 DNA、 RNA堿基(胞嘧啶(C)、 鳥嘌呤(G)、 腺嘌呤(A)、 胸腺嘧啶(T，DNA專有)和尿嘧啶(U，RNA專有)和稀有堿基(5-甲基胞嘧啶(m5C)、 1-甲基腺嘌呤(m1A))在600～1750 cm-1的拉曼光譜Fig.5 Raman spectra of DNA, RNA bases (cytosine (C), guanine (G), adenine (A), thymine (T, DNA-specific) and uracil (U, RNA-specific) and rare bases (5-methylcytosine (m5C), 1-methyladenine (m1A)) from 600 to 1 750 cm-1

3 結(jié) 論

針對DNA和RNA堿基和稀有堿基樣品，應(yīng)用THz-TDS 技術(shù)和拉曼光譜技術(shù)進行了對比研究。結(jié)果表明，在THz-TDS實驗中，胞嘧啶(C)、 鳥嘌呤(G)、 腺嘌呤(A)、 胸腺嘧啶(T，DNA專有)和尿嘧啶(U，RNA專有)和稀有堿基[5-甲基胞嘧啶(m5C)、 1-甲基腺嘌呤(m1A)]在0.2～2.0 THz頻段內(nèi)特征吸收峰和吸收強度差異顯著，可以直觀地識別出7種堿基的差異；拉曼光譜中，7種堿基也表現(xiàn)出很多明顯的不同特征峰，而正是由于拉曼光譜的特征峰雜而多，故不能直觀的識別多種物質(zhì)。且其吸收強度的差異與粉末的厚度，粒度和光聚焦的深度有關(guān)，樣品的熒光還會給拉曼光譜帶來干擾，同時激光還可能會損傷生物樣品。這說明THz-TDS技術(shù)在識別這7種堿基的能力上優(yōu)于拉曼光譜技術(shù)。THz-TDS技術(shù)不僅為DNA和RNA堿基和稀有堿基的識別提供了一種快速和準(zhǔn)確的檢測方法，也為生物遺傳學(xué)研究奠定實驗基礎(chǔ)。