賀俊斌，孟松，潘海學，唐功利

（中國科學院上海有機化學研究所，生命有機化學國家重點實驗室，上海200032）

結(jié)構(gòu)新穎、復雜多樣的天然產(chǎn)物及其衍生物一直以來都是現(xiàn)代藥物的重要組成部分和新藥發(fā)現(xiàn)的重要源泉。研究表明，在1981—2014 年間上市的1500 多種小分子藥物中，超過50%的藥物直接或間接來源于天然產(chǎn)物及其衍生物，包括著名的抗瘧藥青蒿素和抗腫瘤藥紫杉醇［1］。然而，傳統(tǒng)的從植物、微生物及動物中提取分離天然產(chǎn)物的方法往往存在步驟繁瑣、耗時長、成本高、提取效率低等問題，一定程度上制約了新型藥物的研發(fā)［2-3］。因此，人工合成具有重要生物活性、結(jié)構(gòu)復雜、新穎的天然產(chǎn)物具有重要意義。

天然產(chǎn)物全合成主要包括化學合成和生物合成。自1828 年德國化學家W?hler 實現(xiàn)尿素的合成以來［4］，天然產(chǎn)物的化學全合成取得了輝煌的成就，化學家們不斷挑戰(zhàn)合成結(jié)構(gòu)復雜的天然產(chǎn)物，完成了包括維生素B12、?？舅?、軟海綿素等一系列具有里程碑意義的全合成工作［5-9］。盡管人們能夠設(shè)計合成自然界存在的幾乎任何天然化合物，甚至可以合成理論存在但自然界尚未發(fā)現(xiàn)的設(shè)想的理論分子，但在一些含有多手性中心、結(jié)構(gòu)復雜的天然產(chǎn)物化學全合成過程中也存在一些問題，如合成步驟繁瑣（通常幾十步）、產(chǎn)率低（通常＜1%）、產(chǎn)物選擇性不強、反應條件劇烈、需要昂貴試劑或所用有機溶劑易造成污染、難以實現(xiàn)大量合成等［10-11］。近年來，隨著高通量測序技術(shù)、生物信息學、分子生物學等技術(shù)的發(fā)展，天然產(chǎn)物生物合成取得了巨大的進展。以合成生物學、酶催化合成、組合生物合成為主的生物合成為復雜天然產(chǎn)物的全合成提供了有效策略［12-16］。其中，體外酶催化合成因其具有催化效率高、反應選擇性強、產(chǎn)物專一性強、反應條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點［17-20］，吸引了研究人員的關(guān)注。本文作者介紹了近年來采用體外酶催化方法合成復雜天然產(chǎn)物的相關(guān)研究進展，重點介紹了多酶催化串聯(lián)法在復雜天然產(chǎn)物合成中的應用研究進展以及目前存在的問題和解決對策。

1 多酶催化串聯(lián)法合成復雜天然產(chǎn)物

串聯(lián)反應提供了一種新的合成思路，其體系是一套經(jīng)過精心設(shè)計的反應系統(tǒng)，每一步反應的產(chǎn)物都作為下一步反應的底物，在整個反應體系中初始底物經(jīng)過逐步催化后，會最終轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)復雜的功能分子。在復雜天然產(chǎn)物的全合成中設(shè)計串聯(lián)反應體系具有可以節(jié)省原料、溶劑及催化劑用量、減少反應時間、無需進行每步反應之間的分離純化步驟等眾多優(yōu)點［21］。因此，串聯(lián)反應體系已成為天然產(chǎn)物全合成中的重要合成策略。

酶催化串聯(lián)反應源于大自然中生命有機體為了維持生命過程而進化出的各種代謝通路。本質(zhì)上，大自然中的生命體便是一個復雜精妙的一鍋多酶串聯(lián)體系，在這個串聯(lián)系統(tǒng)中，酶作為催化劑，在多個區(qū)間分別參與進行不同的代謝合成反應，多步反應環(huán)環(huán)相扣，最終形成結(jié)構(gòu)復雜、多種多樣的生物活性分子（天然產(chǎn)物）［22-24］。體外酶催化串聯(lián)反應可以分為一鍋串聯(lián)、一鍋分步串聯(lián)以及分步串聯(lián)。一鍋串聯(lián)反應步驟簡單、無需分離中間體產(chǎn)物、合成效率高，但有時體系中存在的輔因子或產(chǎn)生的副產(chǎn)物可抑制某些酶的活性。對此，可采用一鍋分步串聯(lián)或分步串聯(lián)進行解決。然而，一鍋分步串聯(lián)步驟相對繁瑣，需要目標中間體產(chǎn)物產(chǎn)生后，才能進行下一步串聯(lián)反應。此外，分步串聯(lián)需要中間體產(chǎn)物的分離純化，且耗時較長。但不管哪種串聯(lián)方式，相比于化學催化劑，酶作為催化劑的多酶催化串聯(lián)體系往往具有催化效率高、毒性小、反應條件簡單溫和以及容易控制、選擇性強（化學、立體和區(qū)域）、產(chǎn)物構(gòu)型專一、省時環(huán)保等特點，因而在藥物、精細化工品、食品、農(nóng)化產(chǎn)品等的合成生產(chǎn)中得到了廣泛的應用［17-19，23，25-26］。隨著測序技術(shù)、生物信息學、分子生物學、遺傳操作等技術(shù)的發(fā)展，近年來越來越多結(jié)構(gòu)復雜的天然產(chǎn)物的生物合成途徑得到解析，在此基礎(chǔ)上研究者們也采用多酶催化串聯(lián)法成功合成了許多具有重要活性的天然產(chǎn)物。本節(jié)就近年來多酶催化串聯(lián)策略在復雜天然產(chǎn)物合成中的應用作一介紹。

1.1 聚酮類化合物

腸道菌素（enterocin，1）是由日本科學家于1975年分離于鏈霉菌（Streptomycessp.）的一種聚酮類抗生素，具有良好的抗菌活性［27］。隨后人們從海洋微生物S.maritimus中也分離得到腸道菌素（1）以及聚酮類化合物wailupemycins［28］。Moore課題組［28-30］一直從事腸道菌素（1）的生物合成途徑、體外酶催化合成以及類似物合成研究，通過異源表達生物合成基因簇、基因敲除以及體外酶催化實驗成功解析了腸道菌素（1）的生物合成途徑。腸道菌素（1）的生物合成來源于1 分子的苯甲酸（benzoic acid）和7 分子的丙二酸單酰輔酶A（malonyl-CoA），其生物合成基因簇中并不包括編碼環(huán)化酶或芳香化酶的基因，而是包含一個編碼黃素依賴的氧化酶基因（encM），該基因負責催化類Favorskii 氧化重排反應從而形成腸道菌素（1）獨特的籠狀三環(huán)和吡喃酮結(jié)構(gòu)。在解析腸道菌素（1）的生物合成途徑后，該課題組通過表達純化腸道菌素（1）生物合成途徑中的關(guān)鍵酶以及利用商業(yè)化的輔因子蛋白，采用一鍋分步串聯(lián)在體外成功合成了腸道菌素（1），其總產(chǎn)率約25%［31］。值得一提的是，在體外一鍋串聯(lián)EncA/B、EncC、EncD 和EncN 蛋白時，其產(chǎn)物主要以wailupemycin F（2）和wailupemycin G（3）為主。隨后該課題組又通過不同酶相互串聯(lián)以及以苯甲酸類似物為底物，成功在體外酶法全合成了8個5-deoxyenterocin（4）類似物和16 個wailupemycin 類似物，其中包括18 個新化合物［32］。腸道菌素（1）的生物合成、體外酶催化合成以及類似物研究為后來復雜天然產(chǎn)物的生物合成研究提供了很好的思路（圖1）。

Gilvocarcins是S.griseoflavusG?3592 及其他鏈霉菌產(chǎn)生的一系列具有苯并［d］萘［1，2-b］吡喃-6-酮骨架結(jié)構(gòu)的非典型角蒽環(huán)聚酮化合物，具有顯著的抗腫瘤活性［33-34］。 臘伯羅霉素（rabelomycin，5）和defucogilvocarcin M（6）是gilvocarcin 生物合成途徑中的兩個中間體［35-36］。臘伯羅霉素（5）是1970 年分離于橄欖色鏈霉菌S.olivaceusATCC 21549 發(fā)酵液中的一種角蒽環(huán)類抗生素，具有良好的抗革蘭氏陽性菌活性［37］。Rohr課題組［38］利用不同生物合成途徑來源的聚酮合酶，即來源于gilvocarcin、ravidomycin 和杰多霉素（jadomycin）生物合成途徑，采用多酶催化串聯(lián)一鍋法以乙酰輔酶A（acetyl-coA）和丙二酸單酰輔酶A 為底物在體外成功合成了抗生素臘伯羅霉素（5）。該體系包括6 個酶：酮基合成酶KSα和鏈長因子KSβ融合的蛋白JadAB、酰基載體蛋白質(zhì)RavC、?；d體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)酰基酶GilP、聚酮合酶相關(guān)的酮基還原酶GilF、兩個環(huán)化酶RavG 和JadD，經(jīng)一鍋反應2h，臘伯羅霉素（5）的產(chǎn)率可達80%（圖2）。在此基礎(chǔ)上，該課題組又將6個不同來源的后修飾酶（3 個加氧酶GilOI、GilOII 和JadF、2 個甲基轉(zhuǎn)移酶GilM 和GilMT 以及1 個氧化還原酶GilR）與上述聚酮合酶進行串聯(lián)，并加入了輔因子再生所需的黃素還原酶（flavin reductase）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase）；通過15 個酶進行串聯(lián)催化，一鍋法在體外成功合成了defucogilvocarcin M（6）［36］。臘伯羅霉素（5）和defucogilvocarcin M（6）的體外全酶法合成進一步闡明了gilvocarcin生物合成途徑中的氧化重排反應，同時也為角蒽環(huán)聚酮化合物的全合成提供了新的策略。

司替霉素（steffimycin）是1967 年分離于斯特菲斯堡鏈霉菌（S.steffiburgensis）的一種蒽環(huán)類抗生素，具有顯著的抑癌作用；presteffimycinone（7）是其生物合成途徑中的一個關(guān)鍵中間體［39-41］。同樣地，利用光輝霉素（mithramycin）、gilvocarcin和司替霉素生物合成途徑中的不同聚酮合酶和后修飾酶，以乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A（由丙二酰輔酶A：酰基載體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)?；窶atB合成）為底物，通過多酶催化串聯(lián)一鍋法在體外成功合成了presteffimycinone（7），其對確定司替霉素生物合成途徑中環(huán)化酶StfX 和酮基還原酶StfT 的催化順序提供了新的參考（圖2）［39-40］。類似地，聚酮類抗生素特曲霉素（tetracenomycins）也通過體外全酶法催化合成［42-43］。

圖1 多酶催化串聯(lián)法合成腸道菌素（1）和wailupemycinsFig.1 Multienzyme-catalyzed tandem synthesis of enterocin(1)and wailupemycins

1.2 生物堿類化合物

賽洛西賓（psilocybin，8）又名裸頭草堿、裸蓋菇素、光蓋菇素，最早分離于致幻蘑菇Psilocybe屬，是一種具有神經(jīng)致幻作用的神經(jīng)毒素，結(jié)構(gòu)上屬于吲哚生物堿類（色胺衍生物）［44-45］。研究表明，賽洛西賓（8）具有潛在的治療抑郁癥等精神疾病以及藥物上癮的效果，目前正在進行治療抑郁癥的Ⅱ期臨床試驗［46-47］。盡管賽洛西賓（8）在減輕抑郁癥及相關(guān)疾病方面具有潛在的應用價值，但其生物合成途徑一直以來未被解析。最近，F(xiàn)ricke等［48］通過體外酶催化實驗以及生物轉(zhuǎn)化成功解析了賽洛西賓（8）的生物合成途徑，其主要有4個酶參與：色氨酸脫羧酶PsiD、細胞色素P-450 單加氧酶PsiH、激酶PsiK 和甲基轉(zhuǎn)移酶PsiM。進一步的體外多酶催化串聯(lián)一鍋法研究發(fā)現(xiàn)，以4-羥基-L-色氨酸（4-hydroxy-L-tryptophan）為底物，利用PsiD、PsiK和PsiM 三個酶即可在體外實現(xiàn)賽洛西賓（8）的酶法全合成（圖3），產(chǎn)率約26%。賽洛西賓（8）的體外酶法全合成研究進一步體現(xiàn)了多酶催化串聯(lián)法在藥物合成中的重要應用價值。

圖2 Gilvocarcin V和司替霉素的結(jié)構(gòu)式及多酶催化串聯(lián)法合成臘伯羅霉素（5）、defucogilvocarcin M（6）和presteffimycinone（7）Fig.2 Chemical structures of gilvocarcin V and steffimycin and the multienzyme-catalyzed tandem synthesis of rabelomycin(5),defucogilvocarcin M(6)and presteffimycinone(7)

圖3 多酶催化串聯(lián)法合成賽洛西賓（8）Fig.3 Multienzyme-catalyzed tandem synthesis of psilocybin(8)

芐基異喹啉生物堿（benzylisoquinoline alkaloids）是一類結(jié)構(gòu)多樣的重要天然產(chǎn)物，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、心血管保護以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面的藥理活性，如目前廣泛使用的鎮(zhèn)痛藥嗎啡和可待因、抗癌藥長春花堿以及具有抗菌消炎作用的小檗堿等［49-50］。芐基異喹啉生物堿目前主要從開花植物中提取獲得，但存在植物資源匱乏、含量低、提取難度大、純度低等問題；此外，化學全合成又受到產(chǎn)物手性的限制［49，51］。生物合成途徑上，芐基異喹啉生物堿的合成一般以氨基酸作為初始前體，如酪氨酸，再經(jīng)過一系列的羥化、脫羧、甲基化、Pictet-Spengler 縮合以及氧化還原等酶催化反應生成不同的化合物［52］。最近，Wang 等［53］通過多酶催化串聯(lián)反應成功實現(xiàn)了芐基異喹啉生物堿的體外酶法全合成。研究人員首先通過克隆表達與功能驗證實驗，篩選獲得了來源于Candidatus Nitrosopumilus salariaBD31 中的酪氨酸酶CnTYR和糞腸球菌（Enterococcus faecalisDC32）的酪氨酸脫羧酶EfTyrDC，隨后將它們與來源于紫色桿菌 （Chromobacterium violaceum） 的轉(zhuǎn)氨酶CvTAm 和來源于黃唐松草（Thalictrum flavum）的去甲烏藥堿合成酶TfNCS 進行組合，以L-酪氨酸及其衍生物為底物，通過酶催化串聯(lián)一鍋法或分步串聯(lián)在體外成功合成了8 個高立體選擇性的芐基異喹啉生物堿［（9）～（16）］，包括6 個非天然生物堿；其轉(zhuǎn)化產(chǎn)率約35%～99%，分離產(chǎn)率約23%～66%（圖4）。其中，化合物13 能達到克級別規(guī)模的合成，為復雜天然產(chǎn)物的規(guī)?；苽涮峁┝酥匾印?/p>

Thaxtomin 是瘡痂病菌代謝產(chǎn)生的一類植物毒素，最早是在1989 年分離于感染瘡痂病的土豆切片中；thaxtomin 系列化合物是一類含有4-硝基吲哚的二酮哌嗪分子，其化學結(jié)構(gòu)的顯著特征是4-硝基吲哚和C-羥基-2，5-二酮哌嗪環(huán)，差別在于N-甲基、酚羥基以及二酮哌嗪環(huán)上羥基的存在與否以及取代與否［54］。因其獨特的化學結(jié)構(gòu)組成單元，thaxtomin 家族化合物［（17）～（21）］尤其是thaxtomin A（17）作為除草劑和挑選耐受瘡痂病的土豆品種的篩選劑在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有潛在的應用價值［55］。然而在化學全合成thaxtomin 中仍存在立體或區(qū)域選擇等挑戰(zhàn)，而生物合成為其提供了更有效的策略［56-58］。Jiang 等［57］首先通過體外酶催化實驗，確定了thaxtomin 生物合成途徑中TxtA、TxtB和TxtC 三個酶的功能并考察了它們的底物譜，其中TxtA 和TxtB 是兩個非核糖體肽合成酶，它們催化苯丙氨酸和4-硝基色氨酸合成N，N-二甲基二酮哌嗪環(huán)并具有底物寬泛性，而TxtC 是一個細胞色素P-450酶，其可以催化thaxtomin D（20）的C-14和C-20 位發(fā)生羥基化反應。隨后研究人員們將這三個酶與thaxtomin 生物合成途徑中負責催化L-色氨酸（L-tryptophan）C-4 位發(fā)生硝基化反應的P-450酶TxtE（嵌合蛋白TB14）進行串聯(lián)，成功在體外通過酶催化全合成了thaxtomin化合物（圖5）。起初將TB14、TxtA、TxtB以及TxtC進行串聯(lián)，以L-色氨酸和L-苯丙氨酸（L-phenylalanine）為底物一鍋法合成thaxtomin 化合物，但總轉(zhuǎn)化產(chǎn)率低于9%，可能與反應體系中存在的NADPH再生體系有關(guān)。隨后他們采用分步串聯(lián)的策略，即首先串聯(lián)TB14、TxtA 和TxtB 三個酶，然后再加入TxtC，thaxtomin 的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率可達47%。通過多酶催化串聯(lián)一鍋法或分步串聯(lián)一鍋法策略，以L-色氨酸、L-苯丙氨酸以及它們的類似物為底物，Jiang 等［57］在體外實現(xiàn)了124 個thaxtomin 化合物的酶催化全合成，且研究表明部分化合物具有顯著的除草活性（IC50值小于2 μmol/L）。Thaxtomin化合物的體外酶法全合成進一步體現(xiàn)了酶作為催化劑在豐富天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性方面的重要作用。

圖4 多酶催化串聯(lián)法合成芐基異喹啉生物堿[（9）～（16）]Fig.4 Multienzyme-catalyzed tandem synthesis of benzylisoquinoline alkaloids[(9)～(16)]

雙環(huán)霉素（bicyclomycin，22）是日本科學家于1972 年從鏈霉菌中分離獲得的一種抗生素，具有顯著的抗革蘭氏陰性菌活性，也是目前已知的唯一來源于天然產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄終止因子Rho蛋白的選擇性抑制劑［59-61］。雙環(huán)霉素（22）屬于氧雜橋環(huán)二酮哌嗪類化合物，其結(jié)構(gòu)特異，可分為三部分：［4，2，2］-氧雜橋環(huán)骨架、C1 三羥基基團以及C5＝C5a環(huán)外亞甲基（圖6）。作為一種具有橋環(huán)三維結(jié)構(gòu)、脂肪鏈被高度氧化修飾的活性天然產(chǎn)物，雙環(huán)霉素（22）自發(fā)現(xiàn)以來就引起了有機合成化學家的極大興趣，其最高效且立體專一性的化學全合成是由Williams等［62-63］完成，整個合成路線有12步，總產(chǎn)率約為4%～5%。作者課題組一直從事復雜天然產(chǎn)物的生物合成研究，最近通過采用在體外重構(gòu)所有酶催化反應的策略成功解析了雙環(huán)霉素（22）的生物合成途徑［64］。雙環(huán)霉素（22）的生物合成途徑包含7 個酶：1 個環(huán)二肽合酶BcmA、5 個非血紅素鐵依賴的雙加氧酶BcmB/C/E/F/G和1個細胞色素P-450 單加氧酶BcmD。其詳細途徑在體外通過逐個酶催化的方法解析如下：首先，BcmA 催化一分子異亮氨酰tRNA 和一分子亮氨酰tRNA 縮合并環(huán)化，形成雙環(huán)霉素（22）骨架環(huán)異亮氨酸亮氨酸（cIL）；隨后在BcmE、BcmC 和BcmG 催化的連續(xù)羥化反應以及BcmB催化的脫氫-環(huán)氧化作用下，形成具有［4，2，2］-雙環(huán)骨架的氧雜橋環(huán)；最后經(jīng)BcmD 催化的羥化反應和BcmF 催化的脫氫反應形成最終的產(chǎn)物雙環(huán)霉素（圖6）。在此基礎(chǔ)上，以環(huán)二肽cIL 為底物，筆者課題組通過采用分步串聯(lián)策略，即BcmE 首先催化cIL 發(fā)生羥化反應，隨后同時加入BcmB、BcmC、BcmD、BcmF和BcmG，一鍋法在體外實現(xiàn)了雙環(huán)霉素（22）的酶法全合成。雙環(huán)霉素（22）的生物合成途徑中包括了連續(xù)多步惰性C—H鍵活化，以及在C—H鍵活化基礎(chǔ)上的一步脫氫-環(huán)氧化-橋環(huán)形成過程，其體外酶法全合成的實現(xiàn)為構(gòu)筑含有多手性中心中鏈氧雜橋環(huán)的分子提供了的新途徑。

圖5 Thaxtomins的生物合成途徑Fig.5 Biosynthetic pathway of thaxtomins

1.3 萜類和甾體類化合物

赤霉素類（gibberellins，GAs）化合物是一類具有重要生理活性的植物激素，它們參與許多植物的生長發(fā)育過程，如種子發(fā)芽、莖干延長、誘導開花、性別分化等，目前在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、釀造業(yè)、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛應用［65］。赤霉素類化合物在結(jié)構(gòu)上屬于四環(huán)二萜，其生物合成途徑目前基本被闡明。同植物其他萜類化合物的生物合成途徑，赤霉素類化合物的生物合成分為3個過程：牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）的合成，其主要是由乙酰輔酶A 通過甲羥戊酸（mevalonate）途徑或甲基赤藻糖磷酸途徑合成；GA12-醛的合成，其是由GGPP經(jīng)古巴焦磷酸合成酶（copalyl pyrophosphate synthase，CPS）、內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶（ent-kaurene synthase，KS）、內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶（ent-kaurenoic acid oxidase，KAO）以及內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶（ent-kaurene oxidase，KO）催化合成；赤霉素類化合物的合成，包括多步的氧化以及氧化去飽和過程［65］。

2011 年，Sugai 等［66］成功實現(xiàn)了赤霉素GA4（23）的體外酶法全合成（圖7）。研究人員首先以乙酸鈉（sodium acetate）為起始底物，通過甲羥戊酸途徑中4個酶的催化，在體外成功合成了甲羥戊酸，產(chǎn)率約54%。隨后以甲羥戊酸為底物，串聯(lián)6個生物合成相關(guān)的酶，成功在體外合成了關(guān)鍵前體化合物內(nèi)根-貝殼杉烯（ent-kaurene），產(chǎn)率約3%；而將這10個酶串聯(lián)起來也可以通過一鍋法全合成內(nèi)根-貝殼杉烯，但產(chǎn)率僅為0.3%。最后，研究人員將分離得到內(nèi)根-貝殼杉烯為底物，在反應體系中加入兩個P-450氧化酶KO 和KAO 以及兩個非血紅素鐵依賴的氧化酶20ox 和3ox，成功合成了赤霉素GA4（23）。同樣地，將上述14 個酶進行串聯(lián)通過一鍋法全合成GA4（23）時，產(chǎn)率為0.15%。

圖6 雙環(huán)霉素（22）的生物合成途徑（a）和體外酶催化合成（b）Fig.6 Biosynthetic pathway(a)and in vitro multienzyme-catalyzed synthesis(b)of bicyclomycin(22)

熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA，24）屬甾體膽酸類化合物，在臨床上主要用于治療膽結(jié)石、膽汁淤積性肝病、肝炎、脂肪肝等相關(guān)疾?。?7］。UDCA（24）目前主要是由?；蝙Z等動物的膽汁中提取的鵝去氧膽酸（epimer chenodeoxycholic acid，CDCA）通過化學半合成獲得，但其產(chǎn)量并不能有效滿足臨床需求；生物合成中UDCA（24）則是由羥甾類脫氫酶類（hydroxysteroid dehydrogenases，HSDHs）催化CDCA轉(zhuǎn)化產(chǎn)生［68-69］。華東理工大學的許建和課題組［68］最近通過采用酶催化串聯(lián)一鍋法在體外成功實現(xiàn)了CDCA到UDCA的高效轉(zhuǎn)化。研究人員首先鑒定了一個來源于扭鏈瘤胃球菌（Ruminococcus torquesATCC 35915）的自養(yǎng)型羥甾類脫氫酶7β-HSDHRt，隨后將該酶與來源于Clostridium absonum的自養(yǎng)型羥甾類脫氫酶7α-HSDHCa進行串聯(lián)，在體外一鍋法實現(xiàn)了從CDCA到UDCA（24）的合成，產(chǎn)率約73%，但同時存在中間體產(chǎn)物7-O-石膽酸（7-oxolithocholic acid，7-oxo-LCA）約5%。為了減少體系中中間體副產(chǎn)物的產(chǎn)生，研究人員隨后將7α-HSDHCa替換為來源于大腸桿菌（Escherichia coli）的7α-HSDHEc，采用分步串聯(lián)一鍋法進行UDCA（24）的合成，即首先由7α-HSDHEc和乳酸脫氫酶LDH進行CDCA的第一步氧化反應，待CDCA 完全轉(zhuǎn)化后對7α-HSDHEc和LDH進行煮沸滅活；再加入7β-HSDHRt和葡萄糖脫氫酶GDH 進行第二步還原反應。通過分步串聯(lián)一鍋法，UDCA（24）的產(chǎn)率可高達98%（圖8）。

圖7 多酶催化串聯(lián)法合成赤霉素GA4（23）Fig.7 Multienzyme-catalyzed tandem synthesis of gibberellin A4(23)

圖8 多酶催化串聯(lián)法合成熊去氧膽酸（24）Fig.8 Multienzyme-catalyzed tandem synthesis of ursodeoxycholic acid(24)

盡管實現(xiàn)了UDCA（24）的酶法高效合成，但上述酶催化串聯(lián)反應隨著反應時間的延長，其體系中副產(chǎn)物7-oxo-LCA 會還原為CDCA，同時熱處理滅活7α-HSDHEc又耗時繁瑣，大大限制了該法進一步的工業(yè)化應用研究。對此，許建和課題組［69］又采用了固定化酶技術(shù)對UDCA 的酶法合成體系進行了優(yōu)化。固定化酶技術(shù)是用物理法或化學法，將游離酶人工固定在特定載體上進行特有的催化作用，可回收并長時間使用的一種技術(shù)。固定化酶較游離酶具有穩(wěn)定性高、易于控制、可反復使用、回收方便、成本低廉等優(yōu)點，因此在生物工程、醫(yī)學、能源開發(fā)等領(lǐng)域具有重要作用［70-71］。許建和課題組首先篩選了不同的固定化方法，最后將7α-HSDHEc和LDH、7β-HSDHRt-M1（突變體T189V/V207I）和GDH 分別在環(huán)氧化樹脂ES-103 上進行了共固定化，并對固定化條件進行了優(yōu)化。隨后研究人員設(shè)計了一種流動式填充床反應器，以固定化酶LDH-7α-HSDH@ES-103 和7β-HSDH-GDH@ES-103 為催化劑，通過優(yōu)化填充床反應器系統(tǒng)條件，實現(xiàn)了CDCA 到UDCA（24）的高效轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化產(chǎn)率高達100%，時空產(chǎn)率約88.5 g/（L·d）（圖8）［69］。這樣一個將固定化技術(shù)與酶催化串聯(lián)法結(jié)合大量合成UDCA（24）的實例為復雜天然產(chǎn)物的規(guī)模化制備提供了新的思路。

1.4 大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物

多環(huán)特特拉姆酸大環(huán)內(nèi)酰胺（polycyclic tetramate macrolactams，PoTeMs）是一類具有特特拉姆酸結(jié)構(gòu)單元及多環(huán)體系的大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物，具有多樣的生物學活性［72］。斑鳩霉素（ikarugamycin，25）是第一個報道的5/6/5 三環(huán)PoTeMs 化合物， 1972 年從嗜色鏈霉菌（S.phaeochromogenes）中首次分離獲得，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗原蟲、抗?jié)兊壬锘钚裕?3-74］。此外，斑鳩霉素（25）還可抑制巨噬細胞中氧化低密度脂蛋白誘導的攝取以及HIV-1 Nef 誘導的細胞表面CD4 受體蛋白的下調(diào)，被認為是一種網(wǎng)格蛋白依賴性的內(nèi)吞抑制劑［75-76］。斑鳩霉素（25）因其多樣的生物活性自發(fā)現(xiàn)以來就引起了有機合成化學家對其全合成的探索。然而，斑鳩霉素（25）結(jié)構(gòu)的高度復雜性在很大程度上限制了高效化學合成方法的探索，目前化學全合成產(chǎn)率小于1%［72，77］。斑鳩霉素（25）的生物合成途徑由三個酶負責催化：雜合聚酮合酶IkaA（iPKS/NRPS）負責形成特特拉姆酸（26）、氧化還原酶IkaB 負責5/6 雙環(huán)體系的形成、乙醇脫氫酶IkaC 則負責斑鳩霉素（25）中內(nèi)5 元環(huán)的形成［72，74］。此外，斑鳩霉素（25）中的環(huán)己烯基單元可能是通過自發(fā)的Diels-Alder 反應合成［72，74］。Greunke 等［72］通過采用酶催化串聯(lián)一鍋法在體外成功實現(xiàn)了斑鳩霉素（25）的全合成（圖9）。研究人員首先成功表達了來源于Streptomycessp.Tü6239 的蛋白IkaA 和IkaB以及來源于Salinispora arenicolaCNS-205的同源蛋白IkaC。隨后以乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A和L-鳥氨酸（L-ornithine）為底物，在反應體系中同時加入IkaA、IkaB 和IkaC 以及相關(guān)輔因子，實現(xiàn)了斑鳩霉素（25）的體外酶法全合成，產(chǎn)率約9%。此外，為了減少成本，研究人員將IkaA、IkaB和IkaC與合成乙酰輔酶A的乙酸激酶AckA和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶Pta 以及與丙二酸單酰輔酶A 合成酶MatB 進行串聯(lián)，一鍋法在體外也成功實現(xiàn)了斑鳩霉素（25）的酶法全合成。僅利用3個酶，就可構(gòu)筑斑鳩霉素（25）中15 個C—C 鍵、2 個C—N 鍵以及8個手性中心的形成，充分展示了酶催化的神奇之處，也充分體現(xiàn)了酶作為催化劑在復雜天然產(chǎn)物全合成中發(fā)揮的強大作用。

圖9 斑鳩霉素（25）的生物合成途徑Fig.9 Biosynthetic pathway of ikarugamycin(25)

1.5 UK-2A類似物

Fenpicoxamid（商品名Inatreq）是陶氏益農(nóng)公司最新研發(fā)的一種新型吡啶酰胺類農(nóng)用殺菌劑，其被真菌吸收后可在體內(nèi)重新轉(zhuǎn)化為UK-2A［78］。UK-2A 可特異性地抑制電子傳遞鏈泛醌Q1，阻斷線粒體呼吸作用從而發(fā)揮抗真菌作用，且無交叉耐藥性［79］。研究表明，UK-2A 的抗真菌活性主要來源于其C-3 位的3'-羥基-4'-甲氧基吡啶酸結(jié)構(gòu)單元［80-81］。近日，Tan 等［82］通過多酶催化串聯(lián)法成功實現(xiàn)了對UK-2A 藥效官能團C-3-吡啶甲酸結(jié)構(gòu)的定向改造。研究人員首先通過挖掘分析UK-2A 的生物合成基因簇并結(jié)合體外酶催化實驗鑒定了7 個關(guān)鍵基因，闡明了UK-2A 的生物合成途徑。其中，C-3-吡啶甲酸結(jié)構(gòu)的合成是通過腺嘌呤苷酸結(jié)合蛋白UkaF 將3-羥基吡啶酸（3'-hydroxypicolinic acid）上載至肽基載體蛋白UkaG 上，然后經(jīng)P-450 酶UkaL 和甲基轉(zhuǎn)移酶UkaN 的修飾形成最后的C-3 位結(jié)構(gòu)片段。同時，考察UkaF 的底物譜發(fā)現(xiàn)其具有寬泛的底物雜泛性，可識別13 種水楊酸（salicylic acids）及其衍生物。隨后，研究人員通過多酶催化串聯(lián)一鍋法，以3-羥基吡啶酸或13 種水楊酸及其衍生物為底物，在體外成功合成了14 個新的脫?；鵘K-2A（deacyl UK-2A，DAUK-2A）類似物［（27）～（40）］，轉(zhuǎn)化產(chǎn)率高達100%；首次實現(xiàn)了UK-2A 的C-3 位官能團的高效定向改造（圖10）。

圖10 多酶催化串聯(lián)法合成UK-2A類似物Fig.10 Multienzyme-catalyzed tandem synthesis of UK-2A analogues

1.6 核苷類化合物

核苷類似物islatravir（原名MK-8591，41）是美國默克公司研發(fā)的一種HIV 逆轉(zhuǎn)錄酶移位抑制劑，目前正在進行臨床試驗研究，其非凡的功效和長效的作用有望在降低HIV治療次數(shù)和暴露前預防感染中發(fā)揮作用［83-84］。Islatravir（41）主要通過化學合成獲得，但化學合成存在步驟繁瑣（需要12～18 步）且效率低等問題，主要在于難以控制2'-脫氧核糖的立體選擇性［85-86］。鑒于此，Huffman等［87］在天然細菌核苷補救途徑的啟發(fā)下，采用逆向合成思路，通過定向進化改造五種天然酶使其作用于非天然底物，并通過采用多酶催化串聯(lián)一鍋法成功實現(xiàn)了islatravir（41）的經(jīng)濟高效合成（圖11）。

圖11 多酶催化串聯(lián)法合成islatravir（41）Fig.11 Multienzyme-catalyzed tandem synthesis of islatravir(41)

細菌核苷補救途徑為脫氧核糖核苷提供了逆向合成方法，該過程主要使用三種酶降解嘌呤2'-脫氧核糖核苷：嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase，PNP）用磷酸替換核苷堿基得到脫氧核糖1-磷酸；隨后磷酸戊糖變位酶（phosphopentomutase，PPM）將磷酸鹽轉(zhuǎn)移至5位；所得的5-磷酸糖在5-磷酸脫氧核糖醛縮酶（deoxyribose 5-phosphate aldolase，DERA）催化下將醛醇縮醛裂解為3-磷酸甘油醛和乙醛。當逆向合成時，該過程即可從簡單的起始底物合成核苷［88-89］?；诖?，研究人員充分利用了酶催化反應的可逆性，采用逆向合成策略進行islatravir（41）的合成。然而，islatravir（41）結(jié)構(gòu)中具有的炔基取代基和氟取代基不易被天然酶所識別。對此，研究人員首先對核苷補救途徑中的三種酶進行了探索研究。通過定向進化改造來源于E.coli的PNP 和PPM 以及來源于希瓦氏菌（Shewanella halifaxensis）的DERA，成功獲得了對非天然底物具有高活性高耐鹽的PNPRd5BB突變體和高活性的PPMRd3BB突變體，其活性較野生型酶分別提高了70 倍和350 倍；同時也獲得了高選擇性以及對乙醛高耐受的DERARd3BB突變體。由于PNP 和PPM 串聯(lián)的反應被副產(chǎn)物磷酸鹽所抑制，研究人員向反應體系中加入了蔗糖磷酸化酶（sucrose phosphorylase，SP）和蔗糖（sucrose），以消耗副產(chǎn)物無機磷酸鹽，推動反應平衡。為了合成3-磷酸-2-炔基甘油醛（42），研究人員選擇了對2-乙炔基甘油（43）先氧化再磷酸化的路線。通過對E. coli來源的泛酸激酶（pantothenate kinase，PanK）定向進化并將其與海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）來源的熱穩(wěn)定乙酸激酶（acetate kinase，AcK）配對，提高了PanK 的活性（較野生型提高100 倍）和穩(wěn)定性，并實現(xiàn)了PanK 所需輔因子腺苷三磷酸的再生。在氧化還原酶的篩選中，研究人員鑒定了禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）來源的半乳糖氧化酶突變體（galactose oxidase，GOase）并對其進行定向進化，獲得了具有高活性高選擇性的GOaseRd13BB突變體。需要注意的是，GOase 催化的反應體系需要額外的過氧化氫酶和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）。

實現(xiàn)了從2-乙炔基甘油（43）到islatravir（41）合成的每一步反應后，研究人員設(shè)計了一個3 步9 酶催化串聯(lián)反應（圖11）。但由于反應體系中引入的酶量較大，對終產(chǎn)物的過濾造成了困難，同時體系中的PanK 可直接催化初始底物2-乙炔基甘油（41）形成副產(chǎn)物。為此研究人員對PanK（配對Ack）和GOase 進行了酶的固定化操作，減少了水溶液中的酶量，并避免了初始底物的直接磷酸化。最終，通過優(yōu)化酶催化串聯(lián)反應平臺，首次實現(xiàn)了islatravir（41）的規(guī)?；铣桑淇偖a(chǎn)率高達51%，純度高達95%［87］。Islatravir（41）的體外酶法高效全合成是酶催化串聯(lián)法在復雜天然產(chǎn)物合成應用研究中的重大突破，其合成過程中涉及到的逆向合成思維以及定向進化和酶的固定化等策略，為設(shè)計合成其他復雜分子提供了新的思路和重要借鑒。

1.7 其他化合物

除上述介紹的重要實例外，采用體外酶催化串聯(lián)一鍋法合成的天然產(chǎn)物還有維生素B12的前體hydrogenobyrinic acid（45）［90］、聚酮化合物灰黃霉素（griseofulvin，46）［91］、雜萜類merochlorin A（47）和merochlorin B（48）以及napyradiomycin A1（49）和napyradiomycin B1 （50）［92-93］、植物抗毒素camalexin（51）［94］、吡咯并吲哚類生物堿毒扁豆堿（physostigmine，52）［95］、色氨酸衍生物indolmycin（53）［96］、硝基咪唑類抗生素azomycin（54）［97］、糖類化合物碳霉糖（TDP-L-mycarose，55）［98］、多肽類抗生素56［99］、以及免疫抑制劑lipid IVA（57）［100］，其結(jié)構(gòu)見圖12。

圖12 酶催化串聯(lián)法合成的一些其他化合物（45～57）Fig.12 Enzymatic tandem synthesis of other compounds 45～57

2 化學-酶催化串聯(lián)法合成復雜天然產(chǎn)物

化學-酶催化串聯(lián)就是將化學合成與酶催化合成進行串聯(lián)，兩者互補，各取所長，從而完成天然產(chǎn)物的合成?；瘜W催化劑如有機金屬催化劑具有寬泛的底物適用范圍和催化活性，可以彌補某些酶對非天然底物沒有催化活性以及在有機溶劑或高溫下出現(xiàn)的活性喪失等不足；而酶催化劑能在更加簡單溫和的催化條件下將區(qū)域和立體選擇性發(fā)揮到極致，可以解決化學催化劑在沒有誘導劑或保護基團的輔助下難以實現(xiàn)極高手性選擇性的問題。然而，化學-酶催化串聯(lián)體系的實現(xiàn)較為困難，主要源于兩類催化劑所需的催化環(huán)境不同；當生物酶和化學催化劑共存于同一反應體系時往往存在相互抑制的情況［101］。盡管如此，利用酶自身催化反應的高效性、高立體選擇性、高區(qū)域選擇性，以及利用化學催化劑具有的寬廣的底物適用范圍和催化活性，化學-酶催化串聯(lián)在復雜天然產(chǎn)物尤其是高手性化合物的合成中發(fā)揮了重要作用［102-106］。近年來，無論是化學-單酶催化串聯(lián)還是化學-多酶催化串聯(lián)，在復雜天然產(chǎn)物的合成中均取得了巨大的應用進展［107-111］。關(guān)于化學-酶催化串聯(lián)法在復雜天然產(chǎn)物合成中的應用研究進展，目前已有相關(guān)綜述進行了較全面的總結(jié)［101-106，109］。本節(jié)以多殺菌素A（spinosyn A，58）［111］和肝素（heparin）［107］的化學-酶催化串聯(lián)合成研究為例，介紹化學合成與多酶法合成相互結(jié)合在復雜天然產(chǎn)物合成中的重要性。

2.1 多殺菌素A 的合成研究

多殺菌素A（58）是刺糖多胞菌（Saccharopolyspora spinosa）產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其作為生物殺蟲劑多殺菌素的主要活性成分之一，在農(nóng)業(yè)應用中占有重要地位［112］。多殺菌素A（58）分子結(jié)構(gòu)復雜，以含有21 個碳所組成的獨特的5/6/5/12-四環(huán)作為基本骨架，并通過氧糖苷鍵在C-9 位和C-17 位分別與三氧甲基鼠李糖和福樂氨糖連接，整個分子中含有17個手性中心。多殺菌素A（58）的化學全合成已經(jīng)由Evans、Paquette、Roush 和Dai 四個課題組分別獨立完成，但由于多殺菌素A（58）獨特的四環(huán)結(jié)構(gòu)以及分子中眾多的手性中心，在合成過程中給他們帶來了巨大挑戰(zhàn)［103，113］。多殺菌素A（58）的生物合成途徑已被解析（圖13）：其四環(huán)骨架結(jié)構(gòu)（59）是由模塊化Ⅰ型聚酮合酶SpnA-E 催化1 分子丙酰輔酶A、9 分子丙二酸單酰輔酶A 和1 分子甲基丙二酸單酰輔酶A 結(jié)合而成；隨后在SpnJ 的催化下將15-OH 氧化為羰基得到化合物60，并在SpnM 催化下脫水生成多烯化合物61；化合物61 在SpnF 催化的［4+2］-環(huán)加成Diels-Alder 反應中形成化合物62，繼而在鼠李糖轉(zhuǎn)移酶SpnG 作用下進行糖基化，并由SpnL催化C-2 位和C-14 位相連形成化合物63；化合物63 在甲基轉(zhuǎn)移酶SpnH、SpnI 和SpnK 的作用下對鼠李糖單元羥甲基化；最終在SpnP 的催化下引入福樂氨糖合成最終產(chǎn)物多殺菌素A（58）［114-116］。

基于化學催化可合成寬廣的底物和酶催化反應具有很高的立體選擇性和區(qū)域選擇性，研究人員在2014 年采用化學-酶催化串聯(lián)法成功實現(xiàn)了多殺菌素A（58）的全合成（圖13）［111］。由于多殺菌素A 生物合成途徑中化合物59 的結(jié)構(gòu)只是推測而來，尚未分離鑒定，研究人員首先采用化學法合成了多烯大環(huán)內(nèi)酯化合物59?；衔?4 通過不對稱乙基化和羥醛縮合反應等5步轉(zhuǎn)化獲得化合物65，隨后發(fā)生Stille 偶聯(lián)、Julia-Kocienski 烯基化以及Yamaguchi 大環(huán)內(nèi)酯化，經(jīng)7 步轉(zhuǎn)化完成了酶催化前體59 的合成。隨后研究人員以化合物59 為底物，通過在反應體系中加入多殺菌素A（58）生物合成途徑相關(guān)的8 個酶以及優(yōu)化體系中各酶的濃度，在體外一鍋法實現(xiàn)了化合物66 的合成，其總轉(zhuǎn)化產(chǎn)率約19.6%，意味著每一步酶催化反應的平均轉(zhuǎn)化產(chǎn)率至少為81.6%。由于多殺菌素A（58）生物合成途徑中最后一步SpnP 催化的糖基化反應在體外需要輔助蛋白作用才能發(fā)揮活性，而多殺菌素A（58）生物合成基因簇中并沒有相關(guān)編碼基因存在。因此，研究人員最后采用了化學方法，在Lewis 酸活化下對化合物66 引入氨基葡萄糖實現(xiàn)了多殺菌素A（58）的全合成。多殺菌素A（58）的化學-酶催化串聯(lián)全合成工作充分體現(xiàn)了酶催化反應的高效性、專一性和簡便性，同時也證實了化學合成與生物合成相結(jié)合的策略在復雜天然產(chǎn)物合成中的重要價值。

圖13 化學-酶催化串聯(lián)法合成多殺菌素A（58）Fig.13 Chemoenzymatic synthesis of spinosyn A(58)

2.2 肝素的合成研究

化學-酶催化串聯(lián)合成的另一個經(jīng)典的例子是2011 年報道的肝素的全合成［107］。肝素是臨床上廣泛使用的抗凝藥物，是葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）或艾杜糖醛酸（iduronic acid，IdoA）和葡萄糖胺（glucosamine，GlcN）通過1→4 糖苷鍵連接形成的二糖重復單元組成的糖胺聚糖。肝素大小不一、結(jié)構(gòu)各異，第一個化學全合成的五糖抗凝藥磺達肝素（商品名Arixtra）總共涉及50多步反應，且反應條件復雜、產(chǎn)率極低（小于0.1%），極大地限制了商業(yè)化應用［117-118］。肝素的體內(nèi)生物合成首先是在N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶（N-acetyl glucosaminyl transferase） 和肝素合酶（heparosan synthase-2，HS2）的作用下形成N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸交替連接的糖鏈骨架，隨后在N-硫酸化酶（N-sulfotransferase，NST）、C5-異構(gòu)酶（C5-epimerase，C5-epi）以及不同O-硫酸化酶（O-sulfotransferase，OST）的作用下對糖鏈骨架進行修飾，從而得到不同大小及結(jié)構(gòu)的肝素。利用酶催化反應高效的立體專一性，Xu等［107］采用化學-酶催化串聯(lián)法首次實現(xiàn)了兩個超低分子量肝素［（68）和（69）］的合成（圖14）。研究人員借助上述不同的糖基轉(zhuǎn)移酶（來源于E. coliK5 的KfiA和來源于Pasteurella multocida的pmHS2）、硫酸化酶以及C5-異構(gòu)酶，通過精細調(diào)控反應順序，將天然葡萄糖胺、葡糖醛酸及硫酸根進行“組合”，并結(jié)合堿性（三乙胺，triethylamine）條件下的脫保護化學過程，只需10～12 步反應就高效合成了兩個超低分子量肝素［（68）和（69）］，其產(chǎn)率分別為45%和37%，且抗凝血活性與商品藥磺達肝素相當。肝素化學-酶法全合成的實現(xiàn)是化學-酶催化串聯(lián)法在復雜分子合成應用中的里程碑創(chuàng)舉，其為抗凝血藥物肝素的研發(fā)開辟了新的途徑。

圖14 化學-酶催化串聯(lián)法合成超低分子量肝素（68）和（69）Fig.14 Chemoenzymatic synthesis of ultralow molecular weight heparins（68）and（69）

3 結(jié)語

實現(xiàn)天然產(chǎn)物的體外酶法全合成不僅可以拓展“酶”作為催化劑的應用潛力，也為復雜天然產(chǎn)物的制備提供了新的思路。體外酶催化合成具有高效性、高選擇性、反應條件溫和等優(yōu)點，在復雜天然產(chǎn)物的合成中發(fā)揮了獨特的優(yōu)勢。然而，體外酶法全合成的發(fā)展仍面臨諸多挑戰(zhàn)。首先，盡管復雜天然產(chǎn)物的生物合成研究近年來取得了很大進展，但與化學合成相比，人們對于由生物大分子負責的生物合成機制的理解仍顯不足。天然產(chǎn)物的體外酶催化全合成需要在其生物合成途徑了解的基礎(chǔ)上進行，這樣才能保證酶催化反應中初始底物的真實性以及酶催化串聯(lián)反應的有效性。然而一方面天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣，另一方面相似化合物的生物合成途徑也是共性與差異共存，因此人們還需繼續(xù)努力挖掘生物合成基因簇和闡明更多的生物合成途徑。相信隨著測序技術(shù)、生物信息學以及基因編輯、結(jié)構(gòu)生物學、遺傳轉(zhuǎn)化等生物技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多復雜天然產(chǎn)物的生物合成途徑將得到解析，從而為復雜天然產(chǎn)物的體外酶催化全合成奠定基礎(chǔ)。其次，體外酶催化反應的實現(xiàn)需要生物合成途徑中所有參與反應的酶在體外能夠穩(wěn)定獲得且有活性，但目前仍有很多目標蛋白無法通過常規(guī)的生物技術(shù)獲得、或蛋白不穩(wěn)定、或活性很低，極大限制了體外酶催化全合成的應用。另外，復雜天然產(chǎn)物生物合成途徑中參與反應的酶的功能多種多樣、酶學性質(zhì)不同，在體外將它們串聯(lián)在一起時容易出現(xiàn)蛋白互不兼容、反應條件互不合適、中間體產(chǎn)物及輔因子容易抑制一些酶的活性等問題，很大程度上影響了酶催化全合成的效率。對此，可通過優(yōu)化表達系統(tǒng)、篩選同源基因、構(gòu)建融合蛋白等來獲得目標蛋白；通過優(yōu)化反應條件、固定化、定向進化等技術(shù)提高酶的穩(wěn)定性和兼容性。此外，也可通過分步串聯(lián)策略或多酶催化串聯(lián)流動體系提高蛋白穩(wěn)定性、減少中間體產(chǎn)物及輔因子對酶活性的抑制，從而最大程度地提高體外酶催化串聯(lián)體系的合成效率。在體外酶催化途徑的設(shè)計中，應該綜合考慮化學合成和酶催化的優(yōu)勢，不拘泥于全酶串聯(lián)，在一些特殊步驟中引入化學合成也將大大提高整體合成效率。綜上所述，天然產(chǎn)物的體外酶催化全合成研究近年來取得了較大進展，相信隨著合成生物學理念的進一步完善，蛋白質(zhì)工程和酶工程技術(shù)的發(fā)展，體外酶催化全合成將成為復雜天然產(chǎn)物合成的重要手段之一。