黃雪年，唐慎，呂雪峰

（中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，山東省合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266101）

自然界微生物豐富的種質(zhì)資源、代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制的多樣性，結(jié)合合成生物學(xué)使能技術(shù)的快速發(fā)展，構(gòu)成了從研發(fā)優(yōu)質(zhì)微生物底盤細(xì)胞到高效微生物細(xì)胞工廠及終端目標(biāo)產(chǎn)品的微生物合成生物技術(shù)領(lǐng)域。絲狀真菌作為一類重要的微生物，在食品、醫(yī)藥、化工等國(guó)計(jì)民生的領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用，而絲狀真菌合成生物技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)展示了更大的工業(yè)應(yīng)用潛力。

圖1 土曲霉的各種形態(tài)Fig.1 The morphologies of A.terreus

土曲霉是一種環(huán)境中常見的絲狀真菌，具有土褐色致密直柱形分生孢子頭、密集的產(chǎn)孢細(xì)胞和很小的分生孢子（圖1），它的無(wú)性孢子（分生孢子）的萌發(fā)溫度范圍較寬（11～48 ℃），而且能夠耐受高滲透壓，可以廣泛分布于各種生境中。像其他曲霉一樣，土曲霉最初也被認(rèn)為是嚴(yán)格的無(wú)性生殖，通過(guò)產(chǎn)生無(wú)性孢子進(jìn)行傳播繁殖，直到2013 年才首次觀察到它可以進(jìn)行有性繁殖［1］。由于土曲霉并非傳統(tǒng)食品發(fā)酵使用真菌，所以不如米曲霉、黑曲霉和紅曲霉等食品安全使用微生物那樣為大眾所知。但事實(shí)上，土曲霉已經(jīng)在生物化工和醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出了非常大的應(yīng)用價(jià)值，是生物基化學(xué)品衣康酸和降血脂藥物洛伐他汀的工業(yè)生產(chǎn)菌，其產(chǎn)品年銷售額高達(dá)幾十億美元。成功的生產(chǎn)應(yīng)用也證明土曲霉在初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物合成方面都具有很強(qiáng)的能力，并展現(xiàn)出了非常突出的工業(yè)發(fā)酵性能，具有成為典型性絲狀真菌底盤細(xì)胞應(yīng)用于合成生物技術(shù)開發(fā)的價(jià)值。近年來(lái)，土曲霉在工業(yè)菌株改造與發(fā)酵工藝優(yōu)化、生物合成機(jī)制解析等方面都引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，使其合成生物技術(shù)研究方面取得顯著進(jìn)步。本文將對(duì)土曲霉的上述研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)介紹，并對(duì)土曲霉合成生物技術(shù)研究的未來(lái)發(fā)展進(jìn)行討論。

1 土曲霉合成生物技術(shù)工具開發(fā)

與大腸桿菌和釀酒酵母等模式生物相比，絲狀真菌遺傳改造技術(shù)仍不夠系統(tǒng)且相對(duì)低效，可供選擇的篩選標(biāo)記、啟動(dòng)子和終止子等遺傳改造元件也比較有限。目前只有少數(shù)常用的篩選標(biāo)記被證實(shí)在土曲霉中可用，如潮霉素抗性基因hph、吡啶硫氨素抗性基因ptrA、博來(lái)霉素抗性基因ble和基于尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選標(biāo)記pyrG［2-3］，還有一些在其他絲狀真菌中有效的篩選標(biāo)記仍有待驗(yàn)證［4］。

（1）啟動(dòng)子構(gòu)巢曲霉的PgpdA啟動(dòng)子是研究較多的啟動(dòng)子，在絲狀真菌中應(yīng)用廣泛，土曲霉最初遺傳改造也是使用PgpdA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)［5］。此外，構(gòu)巢曲霉PtrpC、PadhA和紅曲霉Pmgpd等異源啟動(dòng)子也有被應(yīng)用于土曲霉遺傳改造中。Tet 誘導(dǎo)啟動(dòng)子系統(tǒng)具有較好的可控性，在黑曲霉中有很好的應(yīng)用效果［6］，Sun 等［7］通過(guò)用Tet 啟動(dòng)子系統(tǒng)替換土曲霉一個(gè)沉默NRPS-like 基因的啟動(dòng)子，成功誘導(dǎo)性激活了該基因。土曲霉糖化酶Gla1 的啟動(dòng)子是最早被使用的土曲霉內(nèi)源啟動(dòng)子，1999 年Villanueva等［8］用該啟動(dòng)子在土曲霉中異源表達(dá)輪狀病毒核衣殼蛋白VP6，但未能檢測(cè)到目的蛋白，可能是目的基因密碼子不匹配，也可能是由于土曲霉糖化酶系本就不發(fā)達(dá)，啟動(dòng)子活性太弱。本文作者研究組為了更好地對(duì)土曲霉工業(yè)菌株進(jìn)行代謝工程改造，對(duì)土曲霉內(nèi)源基因3-磷酸甘油醛脫氫酶基因gpdAt和檸檬酸合酶基因citA的啟動(dòng)子進(jìn)行了系統(tǒng)的比較表征，獲得了簡(jiǎn)短且高效的啟動(dòng)子元件，最短的僅262 bp，克服了很多常用絲狀真菌啟動(dòng)子過(guò)長(zhǎng)（約2 kb）不利于操作的缺點(diǎn)［9-10］。此外，還參照轉(zhuǎn)錄組信息，將基因 ATEG_02809、 ATEG_03846、 ATEG_09960（lovA）、 ATEG_09961 （lovB）、 ATEG_09964（lovD）的啟動(dòng)子應(yīng)用于產(chǎn)洛伐他汀土曲霉工業(yè)菌株改造（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。

（2）同源重組絲狀真菌一個(gè)非常顯著的特點(diǎn)是DNA 雙鏈斷裂修復(fù)過(guò)程主要是依靠非同源末端連接途徑（non-homologous DNA end joining， NHEJ） 和同源重組修復(fù)途徑（homology recombination， HR），這使得在絲狀真菌中外源DNA 主要是通過(guò)隨機(jī)插入的方式整合到基因組上，同源重組整合效率非常低。其優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)只需要表達(dá)某個(gè)目的基因時(shí)，可與篩選標(biāo)記共轉(zhuǎn)化，得到表達(dá)元件整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)都有差異的轉(zhuǎn)化子庫(kù)，這些不確定性有利于篩選到性能更好的轉(zhuǎn)化子。其缺點(diǎn)也很明顯，依賴基因打靶的一些遺傳改造策略執(zhí)行難度大，如基因敲除、基因定點(diǎn)表達(dá)、同源基因或突變體體內(nèi)比較分析、啟動(dòng)子替換等。研究人員在絲狀真菌模式生物粗糙脈孢菌中發(fā)現(xiàn)通過(guò)失活NHEJ 途徑可以顯著提高外源基因的同源重組效率，從而解決基因打靶效率低的問(wèn)題［11］。這一技術(shù)很快被推廣應(yīng)用，極大地促進(jìn)了絲狀真菌的遺傳改造研究。本文作者研究組［12］在土曲霉工業(yè)菌株中通過(guò)敲除ku80基因阻斷NHEJ 途徑，成功將基因打靶效率從不到5%提高到90%以上，隨后進(jìn)一步敲除pyrG基因獲得了尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型底盤細(xì)胞，并建立了基于pyrGAn的雙向篩選遺傳轉(zhuǎn)化體系。最后結(jié)合改良后的Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)對(duì)pyrGAn篩選標(biāo)記進(jìn)行快速切除，實(shí)現(xiàn)篩選標(biāo)記的循環(huán)使用，解決了篩選標(biāo)記不足的問(wèn)題［12-13］。利用這個(gè)遺傳操作平臺(tái)可以對(duì)土曲霉進(jìn)行多基因、多位點(diǎn)、多策略的遺傳改造。

（3）基因編輯基于細(xì)菌和古細(xì)菌免疫機(jī)制開發(fā)的CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，因其簡(jiǎn)單、高效備受矚目，廣泛應(yīng)用于各類生物細(xì)胞的遺傳改造研究中。由于缺乏質(zhì)粒和可靠的強(qiáng)啟動(dòng)子元件等，CRISPR/Cas9 技術(shù)在絲狀真菌中的應(yīng)用進(jìn)度相對(duì)滯后。近幾年經(jīng)過(guò)改良后也被成功地應(yīng)用在越來(lái)越多的絲狀真菌中［14-15］，包括粗糙脈菌［16］、里氏木霉［17］、米曲霉［18］、黑曲霉［19-20］和玉蜀黍黑粉菌［21］等。田朝光課題組［22］在產(chǎn)纖維素酶嗜熱毀絲霉中利用CRISPR/Cas9 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了多個(gè)基因的同時(shí)敲除，顯示出了該技術(shù)在絲狀真菌基因編輯中的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。目前，還沒(méi)有關(guān)于CRISPR/Cas9 技術(shù)在土曲霉中應(yīng)用的報(bào)道。

2 降血脂藥物洛伐他汀的土曲霉細(xì)胞工廠

高血脂是心血管疾病的重要誘因，控制血脂水平是預(yù)防繼發(fā)心血管疾病的有效手段。他汀類藥物能夠通過(guò)抑制羥甲戊二酰輔酶A（HMGCoA）還原酶活性來(lái)降低膽固醇的體內(nèi)合成，成為最主要的降血脂藥物，占市場(chǎng)總額的80%以上。巨大的商業(yè)價(jià)值使得他汀類降血脂藥物研發(fā)成為最成功、最著名的藥物研發(fā)案例之一。洛伐他汀（lovastatin）是由土曲霉合成的一種聚酮類化合物，是首個(gè)被批準(zhǔn)上市的他汀類降血脂藥物（美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局FDA 于1987年批準(zhǔn)），備受矚目。

2.1 洛伐他汀的生物合成

洛伐他汀，又名monacolin K，最早于1979 年在紅曲霉中被首次發(fā)現(xiàn)，隨后Merck公司研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)土曲霉也能合成洛伐他汀，且具有更高的產(chǎn)量，并最終成功應(yīng)用于洛伐他汀的工業(yè)生產(chǎn)［23］。作為明星小分子，土曲霉的洛伐他汀合成基因簇于1999 年被首次鑒定，引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注［24］。通過(guò)一系列的反向遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究，洛伐他汀的生物合成途徑被完全鑒定，整個(gè)合成途徑受特異性轉(zhuǎn)錄激活因子LovE 的調(diào)控，碳骨架主要由兩個(gè)還原型PKS（LovB 和LovF）參與合成（圖2）。首先，LovB 在烯酰基還原酶LovC 的作用下合成dihydromonacolin L［25］，然后在硫酯酶LovG 的作用下從LovB 的ACP 結(jié)構(gòu)域上釋放下來(lái)［26］，接著在細(xì)胞色素P-450 酶LovA 的作用下發(fā)生羥基化和脫水作用生成monacolin L，隨后LovA繼續(xù)催化C8 位發(fā)生羥基化生成母核monacolin J［27］。與此同時(shí)，另外一個(gè)PKS LovF 負(fù)責(zé)合成2-甲基丁酸側(cè)鏈，在?；D(zhuǎn)移酶LovD 的作用下轉(zhuǎn)移至monacolin J 的C8 位羥基上生成終產(chǎn)物洛伐他?。?4，28］。

圖2 土曲霉洛伐他汀生物合成途徑Fig.2 Biosynthesis pathway of lovastain in A.terreus

洛伐他汀工業(yè)生產(chǎn)菌株主要是通過(guò)誘變育種方式篩選獲得的，圍繞生物合成途徑的代謝工程改造的成功案例很少。LaeA 是一個(gè)來(lái)源于構(gòu)巢曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成全局性調(diào)控因子，在土曲霉ATCC20542 中過(guò)表達(dá)LaeA 將洛伐他汀產(chǎn)量提高了4～7 倍［29］。在土曲霉ATCC20542 中用組成型強(qiáng)啟動(dòng)子PadhA替換乙酰輔酶A 羧化酶ACCase的啟動(dòng)子，強(qiáng)化前體供應(yīng)，但是效果并不顯著，只將洛伐他汀產(chǎn)量從62.7mg/L 提高到88mg/L［30］。研究人員還發(fā)現(xiàn)敲除土曲霉ATCC20542 的甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）和SREBP 分裂激活蛋白（ACAP）分別將洛伐他汀產(chǎn)量提高了2.6 倍和5.1 倍［31］。但是這些改造都是在普通低產(chǎn)菌株中進(jìn)行的，洛伐他汀初始產(chǎn)量比工業(yè)菌株低了約兩個(gè)數(shù)量級(jí)，目前還沒(méi)有在高產(chǎn)菌株中成功改造的報(bào)道。

2.2 合成生物技術(shù)策略改進(jìn)辛伐他汀生產(chǎn)工藝

1992 年，Merck 公司又基于洛伐他汀開發(fā)了藥效更好的半合成衍生物辛伐他?。╯imvastatin，Zocor），作為第二代他汀類藥物，迅速成為全球暢銷藥物，專利期過(guò)后年銷售額仍穩(wěn)定達(dá)到30 億美元。與洛伐他汀相比辛伐他汀只是在側(cè)鏈上多了一個(gè)甲基，在工業(yè)上辛伐他汀是以洛伐他汀為原料通過(guò)多步化學(xué)反應(yīng)合成的，其生產(chǎn)工藝大致可分為三個(gè)步驟。首先是土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀，然后通過(guò)堿水解洛伐他汀獲得無(wú)側(cè)鏈的monacolin J，最后通過(guò)化學(xué)方法重新加上新的側(cè)鏈合成辛伐他汀。Tang 課題組基于土曲霉的?；D(zhuǎn)移酶LovD 建立了一種從monacolin J 到辛伐他汀的生物催化方法，可替代原來(lái)的化學(xué)法，該成果獲得2012 年美國(guó)總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎(jiǎng)的綠色合成路線獎(jiǎng)［32-35］。至此，堿水解洛伐他汀生產(chǎn)monacolin J 成為唯一未被生物催化替代的工藝，該過(guò)程復(fù)雜繁瑣、反應(yīng)條件苛刻，而且需要使用大量的濃酸、濃堿和有機(jī)試劑，環(huán)境污染嚴(yán)重，因此開發(fā)一種綠色高效的monacolin J 生產(chǎn)工藝非常有必要。包括Merck 在內(nèi)的研究團(tuán)隊(duì)也曾嘗試開發(fā)生物轉(zhuǎn)化方法，但是由于效率太低，都未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用［36-39］。

基于構(gòu)建的土曲霉遺傳操作平臺(tái)，本文作者研究組以洛伐他汀工業(yè)生產(chǎn)菌株為底盤細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)的代謝工程改造，構(gòu)建了能直接發(fā)酵生產(chǎn)monacolin J 的土曲霉細(xì)胞工廠（圖3）。首先，鑒定了一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的洛伐他汀水解酶PcEST，能夠高效地水解洛伐他汀的2-甲基丁酸側(cè)鏈生成monacolin J，催化效率達(dá)到國(guó)外專利酶的232 倍［40-41］。鑒于該酶的高效催化性能，利用內(nèi)源啟動(dòng)子PgpdAt構(gòu)建了水解酶PcEST 的真菌表達(dá)元件，并整合至洛伐他汀土曲霉工業(yè)生產(chǎn)菌株的基因組上，使PcEST 在土曲霉菌株中高效異源表達(dá)，成功將95%的洛伐他汀轉(zhuǎn)化成monacolin J，獲得了第一代生產(chǎn)monacolin J 的土曲霉細(xì)胞工廠，打通了技術(shù)路線（圖3）［40］。

圖3 生產(chǎn)辛伐他汀前體物monacolin J土曲霉細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)策略Fig.3 Construction of monacolin J-producing cell factory in A.terreus

在工業(yè)生產(chǎn)中洛伐他汀殘留超過(guò)0.5%會(huì)增加分離純化的難度，而第一代細(xì)胞工廠有5%的殘留，會(huì)增加企業(yè)生產(chǎn)成本。研究組開發(fā)了水解酶PcEST 高通量篩選方法，采用定向進(jìn)化技術(shù)獲得了高效的水解酶PcEST 突變體，結(jié)合啟動(dòng)子優(yōu)化構(gòu)建了第二代細(xì)胞工廠，在實(shí)驗(yàn)室條件下成功將殘留控制在0.5%以下，但是發(fā)酵條件變化對(duì)水解效率影響較大，穩(wěn)定性不足并不適合大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)［42］。隨后，研究組通過(guò)基因組重測(cè)序?qū)I(yè)菌株的生物合成途徑和遺傳背景進(jìn)行了分析，利用建立的高效遺傳操作平臺(tái)克服工業(yè)菌株遺傳背景復(fù)雜等困難，實(shí)現(xiàn)了負(fù)責(zé)側(cè)鏈合成的PKS 基因lovF的完全敲除，成功阻斷了洛伐他汀合成的最后一步反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了monacolin J 的高效積累，獲得了完全無(wú)洛伐他汀殘留的第三代土曲霉細(xì)胞工廠［43］。

真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成受環(huán)境因素的影響很大，這些外部因素在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)全局調(diào)控和特異性調(diào)控最終影響到整個(gè)合成途徑。會(huì)使得在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中批次間波動(dòng)很大，增加工藝控制難度，這一現(xiàn)象同樣存在于土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中。研究組在第三代產(chǎn)monacolin J 細(xì)胞工廠的基礎(chǔ)上，以土曲霉內(nèi)源組成型強(qiáng)啟動(dòng)子PgpdAt過(guò)表達(dá)基因簇特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子lovE和構(gòu)巢曲霉laeA，其中過(guò)表達(dá)laeA未能提高monacolin J 的產(chǎn)量。而過(guò)表達(dá)lovE顯著加強(qiáng)lovE的轉(zhuǎn)錄并維持在較高水平，將monacolin J 產(chǎn)量從 10.73mmol/L 提高到了16.36mmol/L，提高了52.5%。此外，還發(fā)現(xiàn)第三代菌株和過(guò)表達(dá)laeA菌株的monacolin J 產(chǎn)量受培養(yǎng)基影響很大，在兩種不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)量相差約30%，而過(guò)表達(dá)lovE的菌株在兩種不同培養(yǎng)基中發(fā)酵合成的monacolin J 差異很小，這說(shuō)明用組成型強(qiáng)啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)lovE有助于維持合成途徑的通量保持穩(wěn)定，從而提高菌株的發(fā)酵魯棒性，對(duì)發(fā)酵環(huán)境變化有更好的適應(yīng)能力［43］。這項(xiàng)工作證明轉(zhuǎn)錄水平的改造是一種很有效的合成生物學(xué)改造策略，不僅能提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)量，還可以提高菌株的發(fā)酵魯棒性。這種改造策略在生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的絲狀真菌工業(yè)菌株中應(yīng)用較少，而該研究是一個(gè)可供參考的成功案例。

3 生物基化學(xué)品衣康酸的土曲霉細(xì)胞工廠

衣康酸是由土曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的一種不飽和二元有機(jī)酸，分子內(nèi)部含有一個(gè)活潑的雙鍵和兩個(gè)羧基，雙鍵和羧基呈共軛關(guān)系，使得衣康酸的性質(zhì)非?；顫?，既可以自身聚合也能與其他單體發(fā)生聚合反應(yīng)，因此廣泛應(yīng)用于化學(xué)合成工業(yè)，例如合成樹脂、塑料、合成纖維和制藥領(lǐng)域等，應(yīng)用前景廣闊［44］。目前衣康酸的全球需求量約為4～6 萬(wàn)噸/年，年銷售額近10 億元/年，并保持逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，市場(chǎng)處于供不應(yīng)求狀態(tài)。基于衣康酸的應(yīng)用前景，美國(guó)能源部已將其列為十二種最具價(jià)值的生物基平臺(tái)化合物之一，引起廣泛關(guān)注［45］。

3.1 衣康酸生物合成途徑

土曲霉合成衣康酸很早就被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，但是直到2002 年發(fā)現(xiàn)順烏頭酸脫羧酶CadA 之后才確定它是通過(guò)順烏頭酸脫羧生成的，2008 年獲得了CadA 的核苷酸序列，并通過(guò)體外酶活和釀酒酵母中異源表達(dá)確定了其活性［46］。2011 年，Li 等［47］通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)cadA的轉(zhuǎn)錄水平確實(shí)與衣康酸產(chǎn)量呈正相關(guān)，而且還發(fā)現(xiàn)毗鄰的三個(gè)基因也表現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)，包括一個(gè)線粒體三羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因mttA、一個(gè)MFS 超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因mfsA和一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，提示這三個(gè)基因可能也與衣康酸的合成相關(guān)，共同組成衣康酸合成基因簇。更有意思的是衣康酸基因簇與洛伐他汀基因簇相鄰，在發(fā)酵工藝研究中也初步發(fā)現(xiàn)兩者的合成具有相關(guān)性，但是尚未被更系統(tǒng)的研究證實(shí)［48］。

基于前期的生物化學(xué)分析和近期的組學(xué)研究結(jié)果，提出了生物合成途徑的模型（圖4）。葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑后進(jìn)行三羧酸循環(huán)生成檸檬酸，烏頭酸酶催化檸檬酸合成順烏頭酸，順烏頭酸在線粒體三羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MttA 的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，然后由定位于細(xì)胞質(zhì)的順烏頭酸脫羧酶CadA 催化脫羧生成衣康酸，最后經(jīng)MFS 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MfsA 分泌至細(xì)胞外［47，49］。另外，檸檬酸也可能通過(guò)MttA 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，然后由細(xì)胞質(zhì)烏頭酸酶催化生成順烏頭酸，繼而合成衣康酸。雖然整個(gè)合成過(guò)程非常簡(jiǎn)單，僅在TCA 循環(huán)的基礎(chǔ)上多了一步由CadA 催化的脫羧反應(yīng)就能合成衣康酸，但是關(guān)于其合成的調(diào)控機(jī)制尚未研究。土曲霉工業(yè)菌株的衣康酸發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)到80g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率高于60%。而三羧酸循環(huán)是高效的物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)換的核心環(huán)節(jié)，順烏頭酸只是烏頭酸酶催化檸檬酸合成異檸檬酸反應(yīng)過(guò)程中的一個(gè)中間體，絕大部分生物中只存在極少量順烏頭酸，因此只有在特殊機(jī)制作用下土曲霉才能實(shí)現(xiàn)衣康酸的高效積累。

3.2 衣康酸菌株代謝工程改造

土曲霉液體深層發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸最早由輝瑞公司于1955 年實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用，近20 年隨著我國(guó)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)水平的快速發(fā)展，衣康酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)基本轉(zhuǎn)移到了我國(guó)。較高的成本（2 美元/千克）仍然是限制其下游應(yīng)用領(lǐng)域拓展的主要因素。雖然在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)菌株誘變和發(fā)酵工藝優(yōu)化已經(jīng)將產(chǎn)量提高到了80g/L，但之后近40 年菌株性能沒(méi)能再進(jìn)一步提高。隨著真菌遺傳改造技術(shù)的進(jìn)步，菌株的理性改造被寄予厚望（圖5）。6-磷酸果糖激酶（PfkA）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶，受下游產(chǎn)物檸檬酸和能量物質(zhì)ATP 的反饋抑制，為了解除通過(guò)PfkA 靶點(diǎn)對(duì)糖酵解的反饋抑制，研究人員通過(guò)定點(diǎn)突變破壞磷酸化位點(diǎn)和刪除抑制物結(jié)合區(qū)域的方式獲得活性更高且不受檸檬酸反饋抑制的PfkA 突變體mtPfkA［50］。隨后，將該突變體酶引入產(chǎn)衣康酸土曲霉菌株中進(jìn)行異源表達(dá)，加快糖酵解途徑的通量，把衣康酸的產(chǎn)量從15g/L提高至30g/L，發(fā)酵周期由150h 縮短為100h，效果顯著［5］。但是該策略在工業(yè)菌株中應(yīng)用時(shí)并沒(méi)有效果，可能是工業(yè)菌株產(chǎn)量已經(jīng)遠(yuǎn)高于30g/L，糖酵解通量已經(jīng)很高，并非限速環(huán)節(jié)［51］。

增強(qiáng)菌株的逆境抵抗力是合成生物技術(shù)研究的重要策略，有利于提高菌株的發(fā)酵強(qiáng)度。工業(yè)生產(chǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中攪拌和通氣的連續(xù)性非常重要，中斷5min 就會(huì)延滯衣康酸的合成并顯著影響最終產(chǎn)量，說(shuō)明在發(fā)酵過(guò)程中呼吸作用非常活躍且很重要，溶氧不足會(huì)打破平衡改變代謝流。為了提高菌株抵抗缺氧逆境的能力，Lin 等［52］通過(guò)在土曲霉中過(guò)表達(dá)透明顫菌血紅蛋白，把衣康酸的發(fā)酵產(chǎn)量由40g/L 提高到46.8g/L。但在工業(yè)菌株中過(guò)表達(dá)透明顫菌血紅蛋白在正常的衣康酸發(fā)酵條件下未能提高產(chǎn)量，只在供氧不足條件下有小幅的改善［9］。另外，在土曲霉發(fā)酵產(chǎn)衣康酸過(guò)程中，快速將大量葡萄糖轉(zhuǎn)化成衣康酸，高強(qiáng)度呼吸作用會(huì)產(chǎn)生氧自由基， 影響細(xì)胞活性， 交替氧化酶（alternative oxidase，AOX）是線粒體呼吸鏈中交替呼吸途徑的末端氧化酶，研究表明它不僅有助于去除氧自由基還有助于提高細(xì)胞抗逆性［53］。研究人員在產(chǎn)衣康酸土曲霉工業(yè)菌株中過(guò)表達(dá)土曲霉內(nèi)源和來(lái)自黑曲霉的異源aoX1基因，衣康酸合成能力不但沒(méi)有提高，反而顯著下降（本文作者課題組未發(fā)表結(jié)果）。這一結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)的AOX 確實(shí)在土曲霉中行使了功能，但是由于衣康酸積累機(jī)制較復(fù)雜，該改造策略整體而言并不有益于衣康酸的積累?？赡苁且驴邓岱e累機(jī)制和能量平衡有關(guān)，因?yàn)榻惶婧粑緩綍?huì)將正常的電子傳遞和能量合成過(guò)程進(jìn)行解離，從而改變細(xì)胞能量狀態(tài)，影響衣康酸的高效積累。

圖4 土曲霉的衣康酸生物合成途徑Fig.4 The biosynthesis pathway of itaconic acid in A.terreus

圖5 產(chǎn)衣康酸土曲霉菌株改造策略Fig.5 Metabolic engineering of the itaconic acid-producing A.terreus

基于生物合成途徑的解析，本研究組在工業(yè)生產(chǎn)菌株中對(duì)衣康酸合成途徑進(jìn)行了系統(tǒng)的代謝工程改造［51］。用強(qiáng)啟動(dòng)子PgpdAt對(duì)衣康酸合成途徑中的關(guān)鍵酶（順烏頭酸脫羧酶CadA、檸檬酸合酶CitA、烏頭酸酶AcoA、丙酮酸羧化酶PYC、三磷酸甘油醛脫氫酶GPD 和黑曲霉6-磷酸果糖激酶突變體mtPfkA）、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（線粒體三羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MttA、衣康酸分泌蛋白MfsA）和調(diào)控因子（ATEG_09969、ATEG_01954）進(jìn)行過(guò)表達(dá)。其中過(guò)表達(dá)順烏頭酸脫羧酶CadA 將衣康酸產(chǎn)量從80.5g/L 提高到88.1g/L，提高了9.4%，并且在生產(chǎn)中顯著縮短了發(fā)酵時(shí)間。MfsA 被推測(cè)是負(fù)責(zé)將衣康酸分泌至細(xì)胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，過(guò)表達(dá)MfsA 將衣康酸產(chǎn)量提高了5%，這顯示MfsA 確實(shí)與衣康酸分泌有關(guān)。但是過(guò)表達(dá)其他基因并沒(méi)有達(dá)到提高產(chǎn)量的效果。

除了合成途徑改造之外，研究人員還關(guān)注了衣康酸降解途徑。研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)土曲霉能夠利用衣康酸作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，這說(shuō)明土曲霉中存在降解衣康酸的途徑。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和體外酶活分析，發(fā)現(xiàn)衣康酸可以在衣康酰-CoA轉(zhuǎn)移酶AtIct、衣康酰-CoA 水合酶AtIch 和檸蘋酰-CoA 裂解酶AtCcl 的作用下轉(zhuǎn)化成丙酮酸和乙酰-CoA，重新回到中心碳循環(huán)中［54］。在工業(yè)菌株中分別敲除這三個(gè)基因，基因缺失菌株的細(xì)胞提取物確實(shí)不再能降解衣康酸，但是在正常發(fā)酵條件下衣康酸產(chǎn)量無(wú)顯著變化?？赡苁且驴邓岚l(fā)酵過(guò)程中葡萄糖供應(yīng)充足，且該條件下有利于衣康酸的合成和積累，降解途徑處于沉默狀態(tài)，因此阻斷降解途徑無(wú)法提高衣康酸的最終產(chǎn)量。

此外，本文作者課題組通過(guò)對(duì)土曲霉菌株進(jìn)行基因工程改造簡(jiǎn)化了衣康酸發(fā)酵工藝［10］。土曲霉的淀粉水解酶系不如黑曲霉發(fā)達(dá)，在工業(yè)上只能利用淀粉水解葡萄糖作為碳源進(jìn)行發(fā)酵，而淀粉水解制糖需要經(jīng)過(guò)淀粉酶處理、高溫噴射液化和糖化酶水解糖化過(guò)程，增加了生產(chǎn)成本。用強(qiáng)啟動(dòng)子在土曲霉中異源表達(dá)來(lái)自黑曲霉的糖化酶gla1，并根據(jù)蛋白組數(shù)據(jù)進(jìn)行信號(hào)肽優(yōu)化，使土曲霉直接利用淀粉液化液發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸的產(chǎn)量從約20g/L 提高到了67.6g/L。再結(jié)合發(fā)酵工藝優(yōu)化，產(chǎn)量達(dá)到78.2g/L，接近利用葡萄糖作為碳源時(shí)的產(chǎn)量，省去了淀粉液化液的糖化過(guò)程。

除了天然生產(chǎn)菌株的改造，也有研究嘗試通過(guò)合成生物技術(shù)用其他異源底盤細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)衣康酸，包括檸檬酸生產(chǎn)菌株黑曲霉、解脂耶氏酵母、大腸桿菌等［55-56］。但是合成能力仍遠(yuǎn)低于土曲霉，圍繞土曲霉工業(yè)菌株的代謝工程改造仍然是重要關(guān)注點(diǎn)。目前土曲霉的改造雖然有一定效果但并未取得重大突破，其原因是關(guān)鍵的衣康酸積累機(jī)制尚不清楚。因此，解析積累機(jī)制并進(jìn)行針對(duì)性的改造仍值得期待，多個(gè)層面的機(jī)制均有可能。在酶學(xué)層面，通常烏頭酸酶催化檸檬酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸的過(guò)程中很少釋放并積累順烏頭酸，土曲霉烏頭酸酶可能具有特殊的酶學(xué)特性使其與其他物種不同，可以積累順烏頭酸進(jìn)而合成衣康酸。在化合物反饋抑制層面，有研究顯示衣康酸能夠抑制異檸檬酸裂合酶活性，因此衣康酸的合成可以進(jìn)一步抑制異檸檬酸經(jīng)TCA 的消耗，從而積累順烏頭酸合成衣康酸。另外，土曲霉合成衣康酸時(shí)需要限氮少磷的條件，提示可能存在物質(zhì)合成與能量/還原力平衡調(diào)控。

4 土曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成研究

絲狀真菌具有很好的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成潛力，產(chǎn)生了許多與人類生活密切相關(guān)的重要次級(jí)代謝產(chǎn)物，如青霉素、他汀類降血脂藥物、免疫抑制劑環(huán)孢霉素以及食品色素等。這些化合物的生物合成主要是由核心酶負(fù)責(zé)合成基本骨架，然后在修飾酶的輔助下合成更具結(jié)構(gòu)多樣性的終產(chǎn)物，這些相關(guān)基因通常會(huì)在基因組上形成一個(gè)特異性的生物合成基因簇。根據(jù)核心基因的不同，次級(jí)代謝產(chǎn)物通?？煞譃榫弁厦福╬olyketide synthase，PKS）合成的聚酮類、非核糖體肽合成酶（non ribosomal peptide synthetase，NRPS）合成的非核糖體肽類、萜烯環(huán)化酶（terpene cyclase，TC）合成的萜類和二甲烯丙基色氨酸合成酶 （dimethylallyl tryptophan synthase，DMATS）合成的吲哚類等。近年來(lái)，組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)絲狀真菌合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛力被嚴(yán)重低估，次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇?cái)?shù)量遠(yuǎn)超預(yù)期，也遠(yuǎn)多于該物種中已發(fā)現(xiàn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物的數(shù)量，在實(shí)驗(yàn)室基本培養(yǎng)條件下大部分基因簇都處于沉默狀態(tài)。如何挖掘這些潛在的次級(jí)代謝產(chǎn)物資源成為新的關(guān)注點(diǎn)，也陸續(xù)開發(fā)了很多激活沉默基因簇策略，大致可以分為非特異性激活和特異性激活兩類［57-60］。

非特異性激活包括單菌多次級(jí)代謝產(chǎn)物方法（one strain-many compounds，OSMAC）、表觀遺傳基因改造、化學(xué)表觀遺傳和全局調(diào)控因子調(diào)控等策略。OSMAC 是基于次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成受復(fù)雜的環(huán)境因素影響，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件可以改變一些合成途徑的轉(zhuǎn)錄水平從而獲得不同的產(chǎn)物，常用的是優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過(guò)與放線菌共培養(yǎng)的方法也成功激活一些化合物的合成途徑［61］。此外，基因的轉(zhuǎn)錄還會(huì)受到表觀遺傳的影響，組蛋白去乙?；?、甲基化和SUMO 化等表觀遺傳修飾會(huì)影響基因組局部區(qū)域是處于常染色質(zhì)還是異染色質(zhì)狀態(tài)，異染色質(zhì)狀態(tài)下基因不會(huì)被轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄不活躍［62］。一些生物合成基因簇就是因?yàn)槲挥诋惾旧|(zhì)區(qū)域從而處于沉默狀態(tài)，敲除負(fù)責(zé)組蛋白去乙?；膆daA基因［63］、甲基化的cclA基因［64］或SUMO 化的sumO基因［65］都可以改變?nèi)旧|(zhì)的表觀遺傳修飾，從而會(huì)影響或激活一些次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成?；瘜W(xué)表觀遺傳策略則是通過(guò)在培養(yǎng)過(guò)程中添加相應(yīng)的組蛋白修飾酶抑制劑來(lái)替代上述相關(guān)基因敲除，從而獲得類似效果［62，66］。全局調(diào)控是真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物調(diào)控的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，LaeA 是研究最多的一個(gè)真菌次級(jí)代謝相關(guān)的全局調(diào)控因子，在曲霉中普遍存在，通過(guò)敲除或過(guò)表達(dá)laeA常被用于促進(jìn)或激活某些次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成［29，67-71］。

特異性激活策略包括核心基因啟動(dòng)子替換、特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子激活和基因簇異源重構(gòu)等。次級(jí)代謝產(chǎn)物骨架通常是由核心基因負(fù)責(zé)合成，用可控強(qiáng)啟動(dòng)子替換核心基因的天然啟動(dòng)子是發(fā)掘新化合物的一個(gè)有效手段［7，72-73］。但是其缺陷也很明顯，次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成通常是需要很多酶或輔助蛋白共同參與的復(fù)雜過(guò)程，包括產(chǎn)物的釋放、轉(zhuǎn)運(yùn)和后修飾等，只激活一個(gè)核心基因得到的只是一個(gè)中間體或者根本無(wú)法得到產(chǎn)物。特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子激活策略可以很好彌補(bǔ)這一不足，獲得了很好的應(yīng)用效果。真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇內(nèi)通常會(huì)有一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以特異性地調(diào)控其所在基因簇的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控代謝產(chǎn)物的合成［74］。通過(guò)啟動(dòng)子替換或者過(guò)表達(dá)方式激活特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以進(jìn)一步激活整個(gè)基因簇，從而獲得最終產(chǎn)物［75-77］。除此之外，將基因簇在模式底盤細(xì)胞中進(jìn)行異源重構(gòu)也是一種常用的基因簇挖掘研究策略［78］，常用的底盤細(xì)胞包括大腸桿菌［79］、釀酒酵母［25］、鏈霉菌［80］和為絲狀真菌開發(fā)的構(gòu)巢曲霉［81］。異源重構(gòu)策略對(duì)于沒(méi)有特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的基因簇尤為重要。它的缺點(diǎn)在于基因簇通常較大，很難準(zhǔn)確預(yù)測(cè)各基因的相關(guān)性和作用順序，目標(biāo)基因數(shù)量多，操作難度大。

土曲霉作為洛伐他汀降血脂藥物開發(fā)的成功案例，其出色的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成能力很早就受到研究者的關(guān)注，發(fā)現(xiàn)了很多新穎的化合物（表1）。生物信息學(xué)分析也證實(shí)了土曲霉確實(shí)具有強(qiáng)大的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成能力，有31 個(gè)PKS、17 個(gè)NRPS、19 個(gè)類NRPS 以及2 個(gè)PKS-NRPS 雜合酶。除了洛伐他汀之外，近年來(lái)還有不少土曲霉基因簇被成功鑒定，并發(fā)現(xiàn)了絲狀真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成新機(jī)制。但是，這些研究主要集中在PKS 和NRPS 類，萜類和吲哚類的研究還比較少。下文將對(duì)部分代表性研究工作進(jìn)行介紹，包括化合物類型、生物合成途徑和研究方法。

表1 土曲霉已被研究基因簇及其下游產(chǎn)物Tab.1 Biosynthetic gene clusters and products identified in A.terreus

續(xù)表

4.1 聚酮類天然產(chǎn)物

聚酮是研究較多的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，土曲霉中共有31 個(gè)PKS 基因，其中13 個(gè)的產(chǎn)物已經(jīng)被鑒定。 其中洛伐他汀基因簇和10， 11-dehydrocurvularin基因簇都分別含有2個(gè)PKS基因，azasperpyranones基因簇含有3個(gè)PKS。

4.1.1 土曲霉酮

土曲霉酮（+）-terrein是土曲霉中最主要的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一，具有抗菌、抗癌、抑制植物生長(zhǎng)等多種生物活性。土曲霉酮的結(jié)構(gòu)于20 世紀(jì)50年代被鑒定，隨后的生物合成途徑研究證明了其來(lái)源于聚酮合成途徑［98］，是從一個(gè)6元環(huán)變到5元環(huán)［82］，直到2014 年其生物合成基因簇和合成途徑才被發(fā)現(xiàn)（圖6）。Zaehle 等［83］在挖掘土曲霉黑色素合成基因簇時(shí)，發(fā)現(xiàn)敲除nrPKS 基因ATEG_00145（terA）使菌株失去了土曲霉酮合成能力。隨后通過(guò)生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)錄水平分析對(duì)其基因簇進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并進(jìn)行了基因敲除驗(yàn)證，結(jié)合異源重構(gòu)提出了其生物合成途徑。TerA 以乙酰輔酶A作為起始單元、以丙二酰輔酶A 作為延伸單元，但它的產(chǎn)物鏈長(zhǎng)控制并不嚴(yán)謹(jǐn)，會(huì)因延伸次數(shù)差異合成不同分子量的產(chǎn)物，當(dāng)4個(gè)丙二酰輔酶A 延伸單元被利用時(shí)會(huì)合成 2， 3-dehydro-6-hydroxymellein，進(jìn)一步被TerB 或其他酮還原酶還原為6-hydroxymellein，并最終在TerC、TerD、TerE 和TerF 的作用下形成終產(chǎn)物土曲霉酮。目前，具體在哪些酶作用下從6 元環(huán)中間產(chǎn)物變成變成5元環(huán)土曲霉酮尚不清楚，有待進(jìn)一步解析。隨后，該課題組還發(fā)現(xiàn)土曲霉酮生物合成至少受三種獨(dú)立的環(huán)境因素誘導(dǎo)，甲硫氨酸、限氮和缺鐵，這些環(huán)境因素通過(guò)全局調(diào)控因子AreA、AtfA 和HapX 將信號(hào)最終傳遞至生物合成基因簇，誘導(dǎo)土曲霉酮合成［99］。

圖6 (+)-Terrein的生物合成基因簇及合成途徑Fig.6 Gene cluster in the biosynthesis pathway of(+)-terrein in A.terreus

4.1.2 土曲霉酸

土曲霉酸（terreic acid）也是一種從土曲霉中分離得到的quinone epoxide化合物，具有良好的抑制布魯頓氏酪氨酸激酶活性而成為潛在的癌癥治療藥物，因此受到關(guān)注。Boruta 等［100］通過(guò)OSMAC 策略激活了土曲霉ATCC20542 中terreic acid的生物合成，然后根據(jù)生物信息學(xué)分析推測(cè)其生物合成的是PKS ATEG_06275 所在基因簇（從ATEG_06272 到ATEG_06278），但是并未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。2014年，Guo等［84］將土曲霉中核心基因atX（ATEG_06275） 兩側(cè)從ATEG_06270 到ATEG_06282的12個(gè)基因分別進(jìn)行敲除，通過(guò)對(duì)敲除菌株發(fā)酵液的分析，鑒定了terreic acid 的生物合成基因簇，并提出了初步的生物合成途徑假設(shè)，但是仍有一些問(wèn)題未解決。隨后，蔡孟浩課題組通過(guò)在甲醇酵母中進(jìn)行合成途徑的異源重構(gòu)，修正并完善了terreic acid 的生物合成途徑［85］。由hrPKS AtX 合成并釋放中間產(chǎn)物6-methylsalicylic acid，在脫羧酶AtA的催化下脫羧羥化形成3-methylcatechol，進(jìn)一步在P-450單加氧酶AtE作用下生成3-methyl-1，2，4-benzenetriol，然后在被環(huán)氧酶AtD 氧化羥基化生成terremutin，最后在氧化還原酶AtC的作用下形成terreic acid（圖7）。

4.1.3 黃綠青霉素

黃綠青霉素（citreoviridin）是一種ATP 合酶抑制劑，被作為乳腺癌靶向治療藥物研究。研究人員發(fā)現(xiàn)生物體中負(fù)責(zé)某抑制劑生物合成的基因簇中通常會(huì)存在一個(gè)額外的靶基因拷貝或者一個(gè)抗性基因，以這些抗性基因作為定位導(dǎo)向，可作為預(yù)測(cè)抑制劑類型次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的有效策略。研究人員利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，citreoviridin 的作用靶點(diǎn)ATP 合成酶β 鏈CtvE 位于hrPKS CtvA（ATEG_09617）所在基因簇內(nèi)，從而推測(cè)該基因簇即負(fù)責(zé)citreoviridin 生物合成。Lin等［90］通過(guò)在構(gòu)巢曲霉中重構(gòu)citreoviridin 生物合成途徑，發(fā)現(xiàn)ctvA、ctvB、ctvC和ctvD即可實(shí)現(xiàn)citreoviridin 的生物合成。首先，由核心酶CtvA 合成一個(gè)α-pyrone 中間體，在SAM 依賴型甲基轉(zhuǎn)移酶CtvB 的催化下羥基甲基化生成citreomontanin，然后末端烯烴異構(gòu)化形成（17Z）-hexaene，再被FAD 單加氧酶CtvC 雙環(huán)氧化，最終由水解酶CtvD催化tetrahydrofuran ring 的形成，進(jìn)而生成終產(chǎn)物citreoviridin（圖8）。

4.2 非核糖體肽類天然產(chǎn)物

非核糖體肽類化合物是由NRPS 合成的含氨基酸次級(jí)代謝產(chǎn)物，土曲霉中共有17 個(gè)NRPS 基因，目前，其中4 個(gè)的產(chǎn)物已經(jīng)被鑒定。

圖7 Terreic acid的生物合成基因簇及合成途徑Fig.7 Gene cluster in the biosynthesis pathway of terreic acid in A.terreus

圖8 Citreoviridin的生物合成基因簇及合成途徑Fig.8 Gene cluster in the biosynthesis pathway of citreoviridin in A.terreus

Acetylaranotin 是一種屬于多硫代二酮哌嗪（epipolythiodioxopiperizine， ETP） 的類真菌毒素，通常具有獨(dú)特的二硫化橋或多硫化橋。根據(jù)絲狀真菌ETP 類化合物生物合成基因簇系統(tǒng)發(fā)育分析，土曲霉中有兩個(gè)疑似NRPS 基因ATEG_03470 和ATEG_08427 負(fù)責(zé)acetylaranotin 的合成［101］。2013 年，Wang 課題組［93］通過(guò)基因敲除的方式確認(rèn)ATEG_03470 是acetylaranotin 合成的核心酶， 敲除ATEG_03470 之后不再合成acetylaranotin。進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)分析和體內(nèi)基因敲除鑒定了acetylaranotin 的生物合成基因簇，包括NRPS 基因ataP（ATEG_03470）和8 個(gè)相關(guān)基因，并基于敲除菌株中間產(chǎn)物積累和生物信息學(xué)分析提出了生物合成途徑（圖9）。兩個(gè)苯丙氨酸在核心酶AtaP 的作用下形成二聚體cyclo-（L-Phe-L-Phe），由AtaTC 中AtaC 結(jié)構(gòu)域催化發(fā)生雙羥基化，然后在AtaIMG 的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（AtaG）作用下結(jié)合兩分子谷胱甘肽，緊接著又通過(guò)二肽酶AtaJ 水解脫去兩分子谷氨酸，在ATaIMG 的碳-硫裂解酶結(jié)構(gòu)域（AtaI）作用下繼續(xù)水解生成表二硫醇中間體。AtaTC 的巰基氧化酶結(jié)構(gòu)域（AtaT）將游離的兩個(gè)巰基氧化形成跨環(huán)二硫化橋，并由P-450 酶AtaF 催化發(fā)生雙環(huán)氧化，進(jìn)一步生成具有吡咯烷結(jié)構(gòu)的中間體，然后在?；D(zhuǎn)移酶AtaH 作用下乙?；?，最終通過(guò)苯甲酸對(duì)-羥化酶AtaY 催化形成oxepine 環(huán)，獲得acetylaranotin［93］。

圖9 Acetylaranotin的生物合成基因簇及合成途徑Fig.9 Gene cluster in the biosynthesis pathway of acetylaranotin in A.terreus

4.3 類非核糖體肽天然產(chǎn)物

NRPS-like 與NRPS 的差異在于C 結(jié)構(gòu)域，被TE 或R 結(jié)構(gòu)域所取代。土曲霉中共有19 個(gè)NRPSlike 基因，Wang 課題組做了比較系統(tǒng)的研究，目前有6個(gè)已經(jīng)完成了產(chǎn)物鑒定［2，7，95］。

黑色素是自然界中一種常見的色素，真菌通過(guò)合成黑色素來(lái)抵御逆境。真菌比較常見的黑色素是一種來(lái)源于真菌聚酮途徑的二羥基萘（DHN）類黑色素，但是基因組挖掘并未在土曲霉中發(fā)現(xiàn)合成DHN 黑色素的PKS 基因。Guo 等［2］發(fā)現(xiàn)在土曲霉中敲除NRPS-like ATEG_03563（atmelA）后，會(huì)產(chǎn)生白化的孢子。進(jìn)一步的基因敲除和體外酶活等實(shí)驗(yàn)證實(shí)ATEG_03563 和酪氨酸酶ATEG_03564 負(fù)責(zé)合成一種新的非典型孢子色素Aspmelanin，并提出了其生物合成途徑［95］。兩分子的對(duì)羥基苯丙酮酸在AtmelA 的作用下生成aspulvinone E，然后在酪氨酸酶TyrP的催化下發(fā)生羥基化生成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，并最終自發(fā)形成孢子色素Asp-melanin。在此期間研究人員還發(fā)現(xiàn)孢子色素Asp-melanin 合成過(guò)程中存在空間調(diào)控現(xiàn)象（圖10）。AtmelA 和ApvA（ATEG_02004）這兩個(gè)NRPS-like 合成的產(chǎn)物都是化合物aspulvinone E，ApvA 只在菌絲中產(chǎn)生aspulvinone E 并最終形成aspulvinone 類化合物，而AtmelA 只在分生孢子中產(chǎn)生aspulvinone E，并最終參與孢子色素的合成［102］。另外還發(fā)現(xiàn)，催化aspulvinone E 形成aspulvinone H 的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶AbpB，同時(shí)還可以催化NRPS-like BtyA（ATEG_02815）的產(chǎn)物butyrolactone Ⅱ發(fā)生類似的反應(yīng)生成butyrolactone I。這種空間分布可能是轉(zhuǎn)錄調(diào)控及酶定位的差異導(dǎo)致的，也說(shuō)明真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。

4.4 萜類天然產(chǎn)物

萜類是最豐富的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)新穎且活性好，在植物和真菌中都有大量存在。土曲霉有很好的萜類合成潛力，含有12 個(gè)萜類生物合成基因簇，絕大部分還未被鑒定，值得關(guān)注。

4.4.1 Aspterric acid

Aspterric acid 是一種強(qiáng)效除草劑，抑制二羥酸脫水酶（DHAD）的活性可達(dá)亞微摩爾級(jí)。土曲霉中aspterric acid 的生物合成基因簇是通過(guò)抗性基因作為預(yù)測(cè)導(dǎo)向被發(fā)現(xiàn)的。研究人員分析發(fā)現(xiàn)DHAD 同源基因astD位于一個(gè)萜類合成基因簇內(nèi)，基因簇中包括一個(gè)TC 基因astA（ATEG_04416），還有兩個(gè)細(xì)胞色素P-450 酶基因astB和astC。由于該基因簇在土曲霉中是沉默的，Yan 等［97］將該基因簇中的基因逐步在釀酒酵母中異源表達(dá)，成功產(chǎn)生了aspterric acid 和其中間體，從而解析了其生物合成途徑（圖11）。farnesyl diphosphate 在AstA的作用下環(huán)化生成（-）-daucane，然后在AstB 的作用下進(jìn)一步氧化，將甲基轉(zhuǎn)化為羧酸并形成環(huán)氧化物，另一個(gè)甲基被AstC 氧化生成羥基并推動(dòng)分子內(nèi)環(huán)氧化合物的開環(huán)，生成aspterric acid。

圖10 土曲霉Asp類黑色素的生物合成機(jī)制Fig.10 Biosynthesis of Asp-melanin in A.terreus

4.4.2 土曲雜萜

圖11 Aspterric acid的生物合成基因簇及合成途徑Fig.11 Gene cluster in the biosynthesis pathway of aspterric acid in A.terreus

土曲雜萜（terretonin）是土曲霉中一種聚酮-萜類雜合的混源萜類化合物，早在20 世紀(jì)80 年代，研究人員就用同位素標(biāo)記證明terretonin 的合成包括聚酮和萜類途徑［103］。這說(shuō)明其生物合成應(yīng)該同時(shí)需要PKS 和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶參與。Guo等［88］通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)nrPKS 基因ATEG_10080（trt4）附近有一個(gè)異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因ATEG_10078（trt2），這表明trt4和trt2可能參與terretonin 的合成。隨后基因敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一推測(cè)，結(jié)合與構(gòu)巢曲霉austiol合成基因簇的比對(duì)分析結(jié)果，最終確定了合成terretonin 基因簇的范圍，并初步提出了terretonin 的生物合成途徑假設(shè)。Matsuda 等［89］通過(guò)在米曲霉中異源重構(gòu)的方式進(jìn)一步完整解析了terretonin 的生物合成途徑。即Trt4 負(fù)責(zé)合成并釋放聚酮化合物3， 5-dimethylorsellinic acid （DMOA）， 然后farnesyl pyrophosphate（FPP）與DMOA 在Trt2 的催化下生成farnesyl-DMOA，緊接著依次在Trt5、Trt8、Trt1、Trt9、Trt3 的作用下發(fā)生甲基化、環(huán)氧化、環(huán)化、氧化和羥基化生成terrenoid，隨后在多功能P-450 酶Trt6 和異構(gòu)酶Trt14 共同作用下形成terretonin D，最終由Trt7 催化兩次氧化生成terretonin（圖12）。該雜合化合物是由基因簇內(nèi)兩個(gè)不同類型核心酶共同參與合成的。

4.5 聚酮-非核糖體肽雜合天然產(chǎn)物

PKS-NRPS雜合酶是一類比較特殊的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成核心酶，此類酶中同時(shí)含有PKS 和NRPS模塊，因此其產(chǎn)物通常是聚酮和氨基酸的含氮復(fù)合物，結(jié)構(gòu)新穎，所以受到關(guān)注。土曲霉NIH2624基因簇注釋結(jié)果顯示土曲霉只有一個(gè)PKS-NRPS雜合酶基因ATEG_00325。近期，本研究組通過(guò)基因組挖掘策略在土曲霉中又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)PKS-NRPS雜合酶ATEG_00913。

圖12 Terretonin的生物合成基因簇及合成途徑Fig.12 Gene cluster in the biosynthesis pathway of terretonin acid

4.5.1 異戊二霉素

PKS-NRPS 雜合酶編碼基因ATEG_00325 所在基因簇在實(shí)驗(yàn)室條件下是沉默的，Gressler 等［96］研究發(fā)現(xiàn)該基因簇的表達(dá)受部分氨基酸的誘導(dǎo)和糖的抑制，RT-PCR 分析顯示在產(chǎn)生異戊二霉素（isoflavipucine）的條件下與ATEG_00325 相鄰的一些基因的轉(zhuǎn)錄水平有相關(guān)性，預(yù)測(cè)isoflavipucine的生物合成基因簇可能包含ATEG_00325、ATEG_00326、 ATEG_00329、 ATEG_00330、 ATEG_00331 這五個(gè)基因，并且通過(guò)同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)推測(cè)了其可能的生物合成途徑，但是很多關(guān)鍵的反應(yīng)還有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（圖13）。這項(xiàng)研究不僅提出了一種系統(tǒng)誘導(dǎo)真菌沉默基因簇的方法，還關(guān)注到了初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物之間的緊密聯(lián)系。

4.5.2 土曲吡喃酮

土曲霉MEFC01 重測(cè)序后進(jìn)行antiSMASH 分析發(fā)現(xiàn)了之前被注釋為PKS 的ATEG_00913（pytA）其實(shí)是一個(gè)PKS-NRPS 編碼基因。由于該基因簇在實(shí)驗(yàn)室條件下是沉默的，本研究組用土曲霉內(nèi)源組成型強(qiáng)啟動(dòng)子PgpdAt替換基因簇中特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ATEG_00919的天然啟動(dòng)子，成功激活了這個(gè)沉默的基因簇，發(fā)現(xiàn)該基因簇合成一類土曲吡喃酮（pyranterreones）化合物。隨后，通過(guò)氨基酸C13 標(biāo)記方式確定雜合酶的NRPS 模塊是選擇絲氨酸作為延伸底物，結(jié)合基因敲除結(jié)果提出了這類聚酮-氨基酸雜合化合物的生物合成途徑（圖14）［76］。該研究從基因組測(cè)序到沉默基因簇激活，再到基因敲除和分子探針標(biāo)記，是絲狀真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物基因組挖掘的一個(gè)成功案例。

4.6 合成一個(gè)目標(biāo)天然產(chǎn)物的兩個(gè)獨(dú)立基因簇間的協(xié)同調(diào)控機(jī)制

如上所述實(shí)例，次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成通常只含有一個(gè)核心基因，只有少數(shù)基因簇中含有兩個(gè)核心基因，如洛伐他汀基因簇含有兩個(gè)PKS。另外，次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因通常位于同一個(gè)基因簇內(nèi)，極少有兩個(gè)獨(dú)立的基因簇共同合成一個(gè)化合物。近期，本研究組在土曲霉中發(fā)現(xiàn)了一種復(fù)雜新穎的絲狀真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成及調(diào)控機(jī)制（圖15）。

圖13 Isoflavipucine的生物合成基因簇及合成途徑Fig.13 Gene cluster in the biosynthesis pathway of isoflavipucine in A.terreus

基因簇A含有ATEG_03629（nrPKS）和ATEG_03630（NRPS-like）兩個(gè)核心基因，基因簇B 含有ATEG_07659（hrPKS）和ATEG_07661（nrPKS）兩個(gè)核心基因，由于這兩個(gè)基因簇在實(shí)驗(yàn)室基本培養(yǎng)基條件下是沉默的，以前報(bào)道都只是通過(guò)異源重構(gòu)方式進(jìn)行了初步鑒定。Zhao 課題組在釀酒酵母中異源表達(dá)了ATEG_03629 和ATEG_03630 這兩個(gè)核心酶基因，發(fā)現(xiàn)其能夠合成5-甲基苔色醛［104］。Wang 課題組通過(guò)在構(gòu)巢曲霉中異源重構(gòu)ATEG_07659/ATEG_07661 基因簇，發(fā)現(xiàn)該基因簇能夠合成asperfuranone［81］。本研究組通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化成功激活這兩個(gè)基因簇，并意外發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)獨(dú)立基因簇共同參與合成一類含有6/6/6/6 稠環(huán)（6/6/6/6 tetracyclic system） 的新化合物azasperpyranones。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)基因敲除和體外酶學(xué)驗(yàn)證，對(duì)兩個(gè)基因簇內(nèi)各基因進(jìn)行了功能分析，系統(tǒng)解析該類化合物的生物合成途徑。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)獨(dú)立的基因簇之間雖然存在空間距離，但是存在一種由三個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子介導(dǎo)的多層級(jí)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使得它們能夠相互協(xié)調(diào)共同參與同一個(gè)化合物的合成［92］。

圖14 Pyranterreones的生物合成基因簇及途徑Fig.14 Gene cluster in the biosynthesis pathway of pyranterreones in A.terreus

圖15 兩個(gè)獨(dú)立基因簇協(xié)同合成化合物azasperpyranonesFig.15 Synergistic synthesis of azasperpyranones under the catalysis of key enzymes encoded by two gene clusters

這是首次在絲狀真菌中發(fā)現(xiàn)由兩個(gè)獨(dú)立的基因簇中的四個(gè)核心基因共同合成一個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物，也是首次發(fā)現(xiàn)兩個(gè)獨(dú)立基因簇在多層級(jí)的協(xié)同調(diào)控機(jī)制下共同作用，這種合成機(jī)制有助于生物合成結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜的化合物，并獲得更加有益于生存的生物活性。該發(fā)現(xiàn)對(duì)于研究絲狀真菌合成復(fù)雜化合物的生物機(jī)制具有重要意義，為真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成途徑解析和新型天然產(chǎn)物基因組挖掘提供了新思路。

5 土曲霉底盤細(xì)胞的合成生物技術(shù)應(yīng)用前景

很多具有應(yīng)用價(jià)值的次級(jí)代謝產(chǎn)物由于天然宿主調(diào)控機(jī)制復(fù)雜、培養(yǎng)難度大或者周期較長(zhǎng)等因素，生產(chǎn)效率非常低，嚴(yán)重阻礙了其應(yīng)用開發(fā)前景，例如植物、難培養(yǎng)微生物和一些極端微生物。隨著合成生物學(xué)近年來(lái)的快速發(fā)展，構(gòu)建目標(biāo)產(chǎn)品導(dǎo)向的異源高效微生物細(xì)胞工廠成為研究熱點(diǎn)。將完整的合成途徑在底盤細(xì)胞進(jìn)行異源重構(gòu)，以避免天然宿主的特異性調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)，而在此過(guò)程中底盤細(xì)胞的選擇非常重要。通過(guò)工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸和洛伐他汀，土曲霉展現(xiàn)出了強(qiáng)大的初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力，以及良好的工業(yè)發(fā)酵性能，生長(zhǎng)快速、營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單且碳源利用率高，工業(yè)生產(chǎn)具有高效率、低成本的優(yōu)勢(shì)。并且土曲霉產(chǎn)孢能力強(qiáng)、抗逆性能好，菌絲體發(fā)酵形態(tài)適合大規(guī)模發(fā)酵，在我國(guó)已經(jīng)建立了成熟的土曲霉發(fā)酵工藝，最大單罐體積300t。由此可知，這些土曲霉工業(yè)菌株具備作為底盤細(xì)胞用于合成生物技術(shù)開發(fā)不同目標(biāo)產(chǎn)品的優(yōu)良條件，工業(yè)發(fā)酵放大難度相對(duì)較小，有利于實(shí)現(xiàn)最終的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

5.1 次級(jí)代謝產(chǎn)物基因組挖掘的異源底盤細(xì)胞

在異源底盤細(xì)胞中重構(gòu)合成途徑是鑒定沉默基因簇的一種有效方法，真菌天然產(chǎn)物由于其生物合成機(jī)制的一些特殊性，使得其在大腸桿菌和釀酒酵母等模式生物中很難高效異源重構(gòu)。首先，大腸桿菌屬于原核生物，缺少真核生物轉(zhuǎn)錄后mRNA 剪接機(jī)制，釀酒酵母雖然屬于真核生物，但是并不能很準(zhǔn)確地識(shí)別其它真核生物基因內(nèi)含子和外顯子，異源表達(dá)時(shí)都需要使用目的基因的cDNA，尤其是在基因簇包含的基因較多時(shí)操作難度會(huì)較大。其次，由于缺少相關(guān)的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶，PKS 和NRPS 在野生型大腸桿菌和釀酒酵母中都沒(méi)有活性，通過(guò)引入合適的外源磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶可以解決該問(wèn)題，但是活性仍舊較低［25，79］。另外，真菌P-450催化系統(tǒng)與原核生物的具有一定特殊性，還原伴侶不能通用，而且絲狀真菌P-450 酶在細(xì)菌或釀酒酵母中功能性表達(dá)難度很大。絲狀真菌作為異源表達(dá)宿主可以很大程度上避免這些問(wèn)題，可以準(zhǔn)確地完成其他真菌來(lái)源基因轉(zhuǎn)錄后的后修飾，不需要額外去除基因中的內(nèi)含子，可以實(shí)現(xiàn)合成基因簇的整體轉(zhuǎn)移整合。研究人員開發(fā)并利用構(gòu)巢曲霉作為底盤細(xì)胞成功鑒定了一些真菌沉默基因簇的產(chǎn)物，這說(shuō)明用絲狀真菌作為底盤細(xì)胞是切實(shí)可行的［81］。但是，如果底盤細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物本身的合成能力較弱，獲得產(chǎn)物量會(huì)很少，會(huì)增加后續(xù)研究的難度。產(chǎn)洛伐他汀土曲霉工業(yè)菌株具有很高的洛伐他汀產(chǎn)量，這說(shuō)明其次級(jí)代謝產(chǎn)物合成能力強(qiáng)，合成前體供應(yīng)充足，P-450 催化系統(tǒng)高效，更容易實(shí)現(xiàn)目標(biāo)途徑化合物的高產(chǎn)，有助于新型天然產(chǎn)物生物合成途徑解析研究。

5.2 聚酮類化合物高效合成的細(xì)胞工廠

聚酮類化合物在絲狀真菌、蕈菌和植物中廣泛存在，并顯示出很好的應(yīng)用價(jià)值，如藥物和天然色素等，很多中藥的活性成分也是聚酮。有些化合物由于產(chǎn)量太低或者培養(yǎng)種植效率太低，大量制備難度大，成本很高，限制了其下游研發(fā)或推廣應(yīng)用。土曲霉工業(yè)菌株卓越的洛伐他汀生產(chǎn)能力說(shuō)明其聚酮類天然產(chǎn)物合成的上游途徑非常發(fā)達(dá)，作為底盤細(xì)胞用于生產(chǎn)其他異源次級(jí)代謝產(chǎn)物，尤其是聚酮類化合物時(shí)可以保證充足的底物供應(yīng)，是目標(biāo)化合物高產(chǎn)的重要保障。例如，蒽醌類化合物大黃素是中藥大黃的主要活性成分，也是一種天然色素，由于中藥植物種植效率低、限制多，使得其成本很高且產(chǎn)能很低，應(yīng)用市場(chǎng)受限。近期，本研究組以產(chǎn)洛伐他汀土曲霉工業(yè)菌株作為底盤細(xì)胞，開發(fā)了能直接合成大黃素的細(xì)胞工廠，初步搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了2g/L［105］。這說(shuō)明土曲霉確實(shí)是聚酮類化合物生物合成的理想底盤細(xì)胞，至于其他類型天然產(chǎn)物的適用性有待評(píng)估。而且，成熟的土曲霉工業(yè)發(fā)酵基礎(chǔ)，使其相較于其它底盤細(xì)胞開發(fā)的細(xì)胞工廠，在發(fā)酵規(guī)模放大方面難度相對(duì)較小，更具產(chǎn)業(yè)化競(jìng)爭(zhēng)力。

5.3 高值有機(jī)酸生物合成的細(xì)胞工廠

如前所述，產(chǎn)衣康酸土曲霉菌株能快速地通過(guò)中心代謝途徑，將簡(jiǎn)單的葡萄糖碳源轉(zhuǎn)化成衣康酸，其他有機(jī)酸副產(chǎn)物極少，說(shuō)明它具有很好的葡萄糖攝取及轉(zhuǎn)化能力。而且該菌株具有很好的低pH 耐受能力，發(fā)酵初始pH 約4.0，開始產(chǎn)酸后pH可降至2.0。例如，反式烏頭酸是一種不飽和三羧酸，具有很好的殺線蟲活性和成為具有重要應(yīng)用價(jià)值生物基化學(xué)品的潛力，但是由于缺乏可靠的生產(chǎn)方式，其應(yīng)用潛力未能挖掘。近期，本研究組以產(chǎn)衣康酸工業(yè)菌株為底盤細(xì)胞，將其改造成能夠發(fā)酵生產(chǎn)反式烏頭酸的細(xì)胞工廠，初步的20t 發(fā)酵罐示范產(chǎn)量達(dá)到30g/L［106］。發(fā)酵過(guò)程中pH 低至1.5，在該條件下大腸桿菌和酵母等底盤細(xì)胞很難正常生長(zhǎng)。因此，在設(shè)計(jì)初級(jí)代謝產(chǎn)物細(xì)胞工廠時(shí)，尤其是酸性化合物，土曲霉是一種可供選擇的底盤細(xì)胞。

6 展望

隨著合成生物技術(shù)的快速發(fā)展，很多微生物底盤細(xì)胞被陸續(xù)開發(fā)和應(yīng)用。土曲霉作為絲狀真菌底盤細(xì)胞，因其卓越的發(fā)酵性能和成熟的工業(yè)應(yīng)用基礎(chǔ)而受到關(guān)注。相較于目前已經(jīng)開發(fā)相對(duì)成熟的其他模式微生物體系，土曲霉合成生物技術(shù)研究還有很多不足之處需要加強(qiáng)。首先，可選用的遺傳元件少，如篩選標(biāo)記、啟動(dòng)子和終止子等，遺傳元件是合成生物技術(shù)開發(fā)的基礎(chǔ)模塊，遺傳改造元件庫(kù)的建設(shè)將是一個(gè)重要研究任務(wù)。尤其是啟動(dòng)子，包括土曲霉在內(nèi)的絲狀真菌啟動(dòng)子元件很少進(jìn)行系統(tǒng)表征，其強(qiáng)弱及變化趨勢(shì)都不明確，這也使得絲狀真菌目前還很難像大腸桿菌和釀酒酵母等模式生物那樣進(jìn)行相對(duì)定量可控性的遺傳改造。其次，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)有待開發(fā)，一些絲狀真菌中已經(jīng)成功開發(fā)了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，展現(xiàn)出明顯先進(jìn)性的同時(shí)也有一些不足，比如編輯效率比在酵母中要低得多，不同基因位點(diǎn)的編輯效率也不同，還有應(yīng)用策略有局限性，目前還僅限于基因的定點(diǎn)突變、替換和敲除破壞。在開發(fā)適用于土曲霉CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的同時(shí)應(yīng)該努力改善上述缺陷。最后，細(xì)胞工廠性能評(píng)估也是合成生物技術(shù)開發(fā)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，相較于單細(xì)胞微生物，多細(xì)胞真菌的高通量分析難度更大，開發(fā)可靠的高通量篩選和發(fā)酵評(píng)估方法將是一個(gè)很具挑戰(zhàn)的任務(wù)。加強(qiáng)上述研究將顯著提升土曲霉及絲狀真菌合成生物技術(shù)研究水平，提供更多可供選擇的設(shè)計(jì)策略，構(gòu)建更加高效的土曲霉細(xì)胞工廠。此外，這些也是絲狀真菌相關(guān)研究中的共性問(wèn)題，土曲霉合成生物技術(shù)研究也將促進(jìn)其他絲狀真菌的發(fā)展。