郭思雨，鄒庭光，朱靜琳，林慧美，許婉毅，黃洪波，陶移文

（廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院分子靶標(biāo)和臨床藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東廣州511436）

紅樹林內(nèi)生真菌作為海洋真菌的第二大生態(tài)群落，因其獨(dú)特的生存環(huán)境造就了耐堿和耐鹽的生理特性，從而產(chǎn)生了多種陸源內(nèi)生真菌所沒有的結(jié)構(gòu)多樣和活性良好的新穎代謝產(chǎn)物［1］。紅樹林內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物為各種新穎抗生素、抗真菌藥、免疫抑制劑和抗癌藥等先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)做出了重大貢獻(xiàn)［2-3］。煙曲霉（Aspergillus fumiga?tus） 屬于絲孢菌綱（Hyphomycetes）、叢梗孢目（Hyphomycetales）、曲霉屬（Aspergillus）真菌［4］，其產(chǎn)生的有些代謝成分會造成人類和動物的肺部真菌疾病［5］，該菌屬分布世界各地，土壤、腐敗有機(jī)物內(nèi)均可繁殖，并且生存適應(yīng)度高、繁殖能力強(qiáng)、代謝產(chǎn)物多樣［6］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，從煙曲霉中產(chǎn)生的具有良好活性的次級代謝產(chǎn)物已經(jīng)超過220 多種［7］，其主要的代謝產(chǎn)物有喹啉類衍生物、二酮哌嗪類衍生物、生物堿類和煙曲霉素類等［8］。毗喃酮類化合物廣泛存在于植物和微生物中，其抗腫瘤活性和抗菌活性突出［9］，因此受到研究者的關(guān)注［10-12］。本課題組對分離自海南省東寨港自然保護(hù)區(qū)紅樹植物無瓣海桑Aspergillus fumigatus?SAS10進(jìn)行了發(fā)酵，并對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定工作，獲得了5個毗喃酮類化合物和兩個酯類化合物。所得7個化合物首次報(bào)道為煙曲霉次級代謝產(chǎn)物，豐富了煙曲霉代謝產(chǎn)物的種類。

圖1 化合物1～7的結(jié)構(gòu)Fig. 1 The structure of compounds 1-7

1 儀器與材料

超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化有限公司，SJ-CJ-2FDQ 型）；高壓蒸汽滅菌鍋（日本松下健康醫(yī)療器械株式會社，MLS-3781L-PC）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海霄漢實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；薄層色譜硅膠HS-GF254（青島海洋化工廠有限公司）；色譜純乙腈（瑞典Oceanpak 公司）；JNM-ECZ 400NB核磁共振波譜儀（日本電子株式會社）；6460 三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜（美國Agilent 公司）；Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；半制備色譜柱Sharpsil-AQ C-18， 250*10.0 mm ID S-5 μm（上海煊美實(shí)業(yè)）。菌株SAS10 采自海南東寨港紅樹林，通過用真菌ITS 引物ITS1 和ITS4 擴(kuò)增真菌18S DNA 序列，所得到的序列在GeneBank 中用Blast 進(jìn)行進(jìn)化樹相似性分析，鑒定為Aspergillus fumigatus 該菌種現(xiàn)保存于廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。

2 發(fā)酵、提取與分離

菌株Aspergillus fumigatus SAS10 用大米培養(yǎng)基在常溫下進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)基配方為1 L 三角瓶裝大米85 g，加質(zhì)量質(zhì)量濃度為2 g/ L 的粗海鹽溶液160 mL，經(jīng)121 ℃滅菌20 min 后接入種子液5 mL，靜置培養(yǎng)40 d。發(fā)酵產(chǎn)物用等量甲醇浸泡48 h，取上清液旋蒸至無甲醇，重復(fù)5次，將提取液濃縮至5 L 后，再用等體積的乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯部位，旋干得乙酸乙酯得粗提物。粗提物經(jīng)硅膠（200～300 目）柱層析分離，采用石油醚-乙酸乙酯（體積比為100∶0，80∶20，67∶33，50∶50，33∶67，20∶80，0∶100）系統(tǒng)等度洗脫，每個等度為三倍柱體積，相應(yīng)獲得7 個（Fr.A-Fr. G）不同極性段的組分。各組分經(jīng)檢測后，對Fr. D 通過半制備HPLC 進(jìn)行分離，流動相為乙腈-水體積比為60∶40 等度洗脫，流速2 mL/min，得到化合物3 和6；將Fr.F 通過半制備HPLC 進(jìn)行分離，流動相為乙腈-水體積比為60∶40 等度洗脫，流速2 mL/min，得到化合物5；將Fr.H進(jìn)行正相硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯（體積比為50∶50，40∶60，30∶70，20∶80，10∶90，0∶100）梯度洗脫，相應(yīng)獲得組分Fr. H1-H6。對其中的Fr. H1、Fr. H2、Fr. H3、Fr. H4 分 別 用 半 制 備HPLC 進(jìn)行分離，流動相分別為乙腈-水，體積比為100∶0、30∶70、30∶70 和25∶75，流速均為2 mL/min，相應(yīng)得到化合物7、1、2和4。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株鑒定

菌株SAS10 經(jīng)18S DNA 序列測定，測序結(jié)果如下。GGGGCTTCTACTGATCGAGGTCACCTTAGAAAAA TAAAGTTGGGTGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCT ACAGAGCAGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGG ACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCG TCCCCCGGGAGAGGGGGACGGGGGCCCAACACAC AAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGAC AGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATG TGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGC AATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTC ATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAA GTTTTAACTGATTACGATAATCAACTCAGACTGCA TACTTTCAGAACAGCGTTCATGTTGGGGTCTTCGG CGGGCGCGGGCCCGGGGGCGCAAGGCCTCCCCGG CGGCCGTCGAAACGGCGGGCCCGCCGAAGCAACA AGGTACGATAGACACGGGTGGGAGGTTGGACCCA GAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGT TCACCTACGGAAACCTTGTTACGATTTTTTACTTC CA

將菌株SAS10與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后，選擇數(shù)據(jù)庫中具有較高序列相似性的已有序列進(jìn)行BLAST，并使用MEGA7.0構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2）。進(jìn)化樹結(jié)果表明SAS10屬于Aspergillus fumigatus。

3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

圖2 SAS10的進(jìn)化樹Fig. 2 The evolutionary tree of SAS10

化合物1：黃色粉末，24.0 mg。ESI-MS：m/z 187.2［M+H］+，結(jié)合13C NMR 和1H NMR 數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C12H10O2，不飽和度為8。詳細(xì)核磁數(shù)據(jù)如下：1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.07（d，J = 5.7 Hz，1H），7.38～7.25（m，5H），6.22（dd，J = 5.8，2.4 Hz，1H），6.18（d，J = 2.4 Hz，1H），3.89（s，2H）；13C NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：177.9，168.1，156.5，135.7，129.0（2C），128.7（2C），127.1，115.9，114.8，38.8。與文獻(xiàn)［13］數(shù)據(jù)基本一致，故化合物1鑒定為aspergyllone。

化合物2：白色不定型粉末，3.4 mg。ESIMS：m/z 203.1［M+H］+，［α］20D= +76.6（0.1 mol/L，CH3OH），結(jié)合13C NMR 和1H NMR 數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C12H10O3，不飽和度為8。詳細(xì)核磁數(shù)據(jù)如下：1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.05（d，J = 5.8 Hz，1H），7.43～7.28（m，5H），6.42（d，J=2.6 Hz，2H），6.21（dd，J=5.8，2.6 Hz，1H），5.48（d，J=2.3 Hz，1H）；13C NMR（DMSO-d6，100 MHz ）δ：177.7，169.9，156.1，140.3，128.3（2C），127.9，126.6（2C），116.0，112.0，71.0。與文獻(xiàn)［14］數(shù)據(jù)基本一致，故化合物2 鑒定為（R）-2-（hydroxy（phenyl）methyl）-4H-pyran-4-one。

化合物3：黃色粉末，5.2 mg。ESI-MS： m/z 230.1［M+H］+，結(jié)合13C NMR 和1H NMR 數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C13H11NO3，不飽和度為9。詳細(xì)核磁數(shù)據(jù)如下：1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.79（s，1H），8.55（s，1H），7.77（s，1H），7.38～7.28（m，5H），6.43（s，1H），3.98（s，2H）；13C NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：177.7，168.8，163.0，162.2，135.3，129.1（2C），128.8（2C），127.3，119.3，115.5，38.3。與文獻(xiàn)［15］ 數(shù)據(jù)基本一致，故化合物3鑒定為carbonarone A。

化合物4：棕色粉末，1.9 mg。ESI-MS：m/z 262.1［M+Na］+，［α］20D=-37.2（0.1 mol/L，CH3OH），結(jié)合13C NMR 和1H NMR 數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C12H17NO4，不飽和度為5。詳細(xì)核磁數(shù)據(jù)如下：1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.26（d，J = 8.2 Hz，1H），6.09（d，J = 2.2 Hz，1H），5.57（d，J =2.2 Hz，1H），4.34（t，J = 8.2 Hz，1H），3.80（s，3H），1.88（s，3H），0.88（d，J = 6.8 Hz，3H），0.82（d，J=6.8 Hz，3H）；13C NMR（DMSO-d6，100 MHz ）δ：170.8，169.4，163.9，163.3，99.8，87.9，56.5，56.2，29.9，22.4，19.2，18.4。與文獻(xiàn)［16］數(shù)據(jù)基本一致，化合物4 鑒定為campy?rone A。

化合物5：黃色粉末，3.5 mg。ESI-MS：m/z 254.1［M+H］+，［α］=-17.3（0.1 mol/L，CH3OH），結(jié)合13C NMR 和1H NMR 數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C13H19NO4，不飽和度為5。詳細(xì)核磁數(shù)據(jù)如下：1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.28（d，J = 8.5 Hz，1H），6.09（d，J = 2.2 Hz，1H），5.56（d，J =2.2 Hz，1H），4.39（t，J = 8.5 Hz，1H），3.80（s，3H），1.86（d，J = 3.2 Hz，3H），1.83～1.75（m，1H），1.45（m，1H），1.17～1.06（m，1H），0.83（t，J=7.4 Hz，3H），0.78（d，J=6.8 Hz，3H）；13C NMR（DMSO-d6，100 MHz ）δ：170.7，169.3，163.9，163.3，99.9，87.9，56.4，54.9，36.0，24.6，22.4，15.5，10.8。與文獻(xiàn)［16］數(shù)據(jù)基本一致，化合物5鑒定為campyrone C。

化合物6：黃色油狀，4.7 mg。ESI-MS： m/z 235.1［M+Na］+，結(jié)合13C NMR 和1H NMR 數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C11H16O4，不飽和度為4。詳細(xì)核磁數(shù)據(jù)如下：1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：4.36（s，1H），3.37（s，2H），2.40（t，J=7.5 Hz，2H），1.99（s，3H），1.51～1.45（m，2H），1.43 ～1.35（m，2H），1.32～1.26（m，4H）；13C NMR（DMSOd6，100 MHz）δ：166.5，166.3，143.5，140.9，60.6，32.4，28.5，27.0，25.2，23.6，9.3。與文獻(xiàn)［17］ 數(shù) 據(jù) 基 本 一 致， 化 合 物6 鑒 定 為asperfurandione A。

化合物7：棕色油狀，3.1 mg。ESI-MS： m/z 279.1［M+H］+，結(jié)合13C NMR 和1H NMR 數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C16H22O4，不飽和度為6，詳細(xì)核磁數(shù)據(jù)如下：1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.71（m，2H），7.66（m，2H），4.28～4.16（m，4H），1.70～1.59（m，4H），1.43～1.31（m，4H），0.91（t，J = 7.4 Hz，6H）；13C NMR（DMSO-d6，100 MHz） δ：166.9，131.7，131.5，128.6，65.0，30.0，18.6，13.5。與文獻(xiàn)［18］數(shù)據(jù)基本一致，化合物7鑒定為dibutylterephthalate。

4 結(jié)果和討論

對紅樹林植物無瓣海桑的內(nèi)生真菌Aspergillus fumigatus SAS10進(jìn)行發(fā)酵，從其發(fā)酵粗提物中共分離并鑒定7 個化合物，5 個毗喃酮類和兩個酯類化合物，說明該菌株有很大產(chǎn)生毗喃酮類化合物的潛力。文獻(xiàn)報(bào)道，該類化合物對多種致病菌和腫瘤細(xì)胞有較好的抑制活性，如化合物1對熱帶念珠菌（Candida tropicalis）、近平滑念珠菌（ATCC 22019）有中等強(qiáng)度的抗真菌活性［13］；化合物3 對白色念珠菌（Candida albicans）有中等強(qiáng)度的抑菌活性，對克魯斯念珠菌（Candida krusei）有較強(qiáng)的抑制活性，也顯示出對植物病原性細(xì)菌（Dickeya solani van der Wolf）具 有 一 定 的 抑 制 活 性［13］；同時，化合物1 和2 對人體胰腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出中等強(qiáng)度的抑制活性［14］，化合物3 對K562 細(xì)胞有中度抗增殖活性［15］；化合物6 顯示對芽孢桿菌、新型隱球菌和白色念珠菌有中等抑菌活性［17］。7個化合物首次報(bào)道為南海紅樹林內(nèi)生真菌煙曲霉次級代謝產(chǎn)物，為毗喃酮類化合物的獲取提供了新來源。后續(xù)，我們將繼續(xù)挖掘紅樹林內(nèi)生真菌的抗腫瘤、抗菌等活性物質(zhì)，獲得新的藥物先導(dǎo)化合物。