許妍妮，趙俐婷，賀芳，張燕

作者單位：1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安710061；2陜西地礦醫(yī)院，陜西 西安710014

葡萄籽提取物（grape seed extract，GSE）是從葡萄籽中提取分離得到的一類多酚類純天然物質(zhì)，主要由原花青素、兒茶素、表兒茶素、沒食子酸等多酚類物質(zhì)組成［1］。GSE是一種抗氧化劑，具有很強(qiáng)的體內(nèi)活性，是迄今發(fā)現(xiàn)的植物來源最高效的抗氧化劑之一［2］。GSE是一種天然成分，具有保護(hù)心肌、抗氧化、消炎、清除自由基、抗癌作用，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用功能。?zden等［3］研究發(fā)現(xiàn)，GSE可有效減少牙周疾病的炎性反應(yīng)；Toker等［4］研究發(fā)現(xiàn)，GSE可通過減少M(fèi)MP-8和HIF-1α水平降低大鼠牙槽骨損失和牙周疾病炎性反應(yīng)，同時可提高成骨細(xì)胞活性；Park等［5］研究發(fā)現(xiàn)，GSE可有效減少膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型的炎性反應(yīng)和骨吸收。但GSE是否影響破骨細(xì)胞形成未見報道。

破骨細(xì)胞來源于髓細(xì)胞和多功能造血干細(xì)胞分化而來的單核巨噬細(xì)胞，在巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）和核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kBligand，RANKL）的雙重刺激下，單核巨噬細(xì)胞不斷融合，最終分化成為具有骨吸收功能的破骨細(xì)胞［6］?；罨疶-細(xì)胞核因子1（nuclear factor of activated Tcells，cytoplasmic 1，NFATc1）是破骨細(xì)胞分化過程中最為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在NFATc1的作用下，破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistantacid phosphatase，TRAP）和組織蛋白酶K（cathepsin K）等功能分子發(fā)揮特定功能［7］。本研究自2108年1月至2019年1月檢測葡萄籽提取物對破骨細(xì)胞分化的影響，以期為臨床上治療骨質(zhì)疏松等疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系（RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳，每3天傳代1次。

1.2試劑GSE購自于美國GNC公司；巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受體活化因子配體（RANKL）購自美國Peprotech公司。

1.3細(xì)胞誘導(dǎo)分化用破骨細(xì)胞誘導(dǎo)液（含有30 ng∕mL M-CSF、100 ng∕mL RANKL 的 10%FBS α-MEM完全培養(yǎng)基）進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，每2天換液一次，5 d后待細(xì)胞出現(xiàn)明顯的破骨細(xì)胞形態(tài)特征（多核、巨大），即誘導(dǎo)分化成功。

1.4實(shí)時定量基因擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)（qPCR）檢測破骨細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá)提取總RNA，提取細(xì)胞總RNA，取1μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA稀釋10倍后使用TaKaRa實(shí)時熒光定量試劑盒，進(jìn)行qPCR，反應(yīng)體系為：2×mix 10 μL、正∕反向游引物（10 μmol∕L）0.5 μL、cDNA模板5μL，補(bǔ)H2O至20μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。使用GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。檢測破骨分化標(biāo)志分子Itgb3、Acp5、Ctsk的mRNA水平。

1.5 TRAP染色根據(jù)TRAP染色試劑盒（Sigma）說明書進(jìn)行染色。等量混合亞硝酸鈉溶液和堅牢石榴紅GBC鹽溶液，依次加入萘酚AS-BI磷酸溶液、醋酸鹽溶液、酒石酸鹽溶液，充分混合，配制成染色液。4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，加入適量染色液，37℃染色40 min。在光學(xué)顯微鏡下觀察，將有3個或3個以上核的TRAP陽性細(xì)胞認(rèn)定為破骨細(xì)胞，并在每個孔的不同區(qū)域隨機(jī)選擇視野進(jìn)行計數(shù)。

1.6 c-TX水平檢測在骨片上誘導(dǎo)破骨細(xì)胞，6 d后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒檢測c-TX水平。具體步驟是：將標(biāo)準(zhǔn)品工作液和細(xì)胞培養(yǎng)上清加入到酶標(biāo)板中，2個復(fù)孔，每孔100μL。37℃孵育90 min。棄去液體，甩干，立即加入生物素化抗體工作液100μL，混勻后37℃孵育1 h。甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液300μL，浸泡2 min后在厚吸水紙上拍干。重復(fù)此洗板步驟3次。每孔加酶結(jié)合物工作液100μL，混勻后37℃孵育30 min。洗板5次。加底物溶液100μL，混勻后37℃避光孵育20 min。加終止液50μL終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的光密度（OD值）。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均為3次生物學(xué)重復(fù)。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett’st檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1葡萄籽提取物抑制破骨細(xì)胞標(biāo)志分子表達(dá)RAW264.7細(xì)胞分為兩組，分別為對照組（無葡萄籽提取物）、GSE組（細(xì)胞培養(yǎng)液中添加終濃度100μg∕mL的葡萄籽提取物）。對兩組RAW264.7細(xì)胞用含30 ng∕mLM-CSF、100 ng∕mLRANKL的10%FBS α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化，每2天換液一次，5 d后收集細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qPCR檢測破骨細(xì)胞分化標(biāo)志分子Itgb3、Acp5、Dcst、Ctsk的mRNA水平。結(jié)果如圖1所示，細(xì)胞克隆經(jīng)誘導(dǎo)分化后，與對照組相比，GSE組細(xì)胞的破骨標(biāo)志分子Itgb3 mRNA相對表達(dá)量由（216.59±34.61）下降至（104.55±9.54）（n＝3，P＝0.0355）；Acp5由（103.37±14.77）下降至（78.96±13.15）（n＝3，P＝0.0351）；Dcst由（304.85±14.77）下降至（65.03±11.75）（n＝3，P＝0.0003）；Ctsk由（290.23±41.65）下降至（132.23±14.06）（n＝3，P＝0.022 9）。以上分化標(biāo)志分子mRNA水平均顯著降低，提示葡萄籽提取物抑制破骨細(xì)胞分化。

2.2葡萄籽提取物抑制破骨細(xì)胞形成對照組、GSE組RAW264.7細(xì)胞用含30 ng∕mL M-CSF、100 ng∕mL RANKL的10%FBSα-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化5 d，固定后進(jìn)行TRAP染色。結(jié)果如圖2所示，與對照組細(xì)胞相比，GSE組細(xì)胞形成的TRAP陽性細(xì)胞數(shù)目顯著減少，提示葡萄籽提取物抑制破骨細(xì)胞形成。

圖1 實(shí)時定量基因擴(kuò)增熒光檢測破骨細(xì)胞標(biāo)志分子表達(dá)：A為Itgb3，B為Acp5，C為Dcst，D為Ctsk

為了進(jìn)一步炎癥葡萄籽提取物對破骨細(xì)胞形成的抑制作用，我們同時收集了細(xì)胞培養(yǎng)上清液，進(jìn)行了TRAP活性檢測。結(jié)果如圖3所示，GSE組細(xì)胞培養(yǎng)上清TRAP活性由（2.52±0.39）下降至（0.91±0.10）（n＝3，P＝0.0165），再次證實(shí)了葡萄籽提取物對破骨細(xì)胞形成的抑制作用。

2.3葡萄籽提取物抑制破骨細(xì)胞功能對照組、GSE組RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于骨片上，用含30 ng∕mL M-CSF、100 ng∕mL RANKL的10%FBS α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化6 d，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，進(jìn)行了c-TX檢測。結(jié)果如圖4所示，與對照組細(xì)胞相比，GSE組細(xì)胞分泌的c-TX量由（1.01±0.11）nmol∕L下降至（0.49±0.06）nmol∕L（n＝3，P＝0.0028），提示葡萄籽提取物抑制破骨細(xì)胞活性。

圖3 TRAP活性檢測破骨細(xì)胞形成

3 討論

骨質(zhì)疏松是絕經(jīng)后婦女常見的一種退行性骨骼疾病，其病理特征為骨量減少、骨折概率增加［8］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，約60%的60歲以上老人患有不同程度的骨質(zhì)疏松。在骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折中，髖、脊椎骨折最為常見［8］。髖部骨折后一年內(nèi)由于各種并發(fā)癥導(dǎo)致的死亡率高達(dá)20%，存活者中約40%因長期臥床導(dǎo)致關(guān)節(jié)固定僵直、功能喪失，生命質(zhì)量明顯下降［8］。骨質(zhì)疏松程度相對較輕的病人往往也要常年忍受四肢及腰背部疼痛、反復(fù)骨折等痛苦。目前臨床上使用的治療骨質(zhì)疏松藥物主要從抗破骨方面來發(fā)揮作用，如雙膦酸鹽、降鈣素等，但其副作用較大，不能長期使用。因此，開發(fā)安全的天然活性物質(zhì)是目前研究的熱點(diǎn)。

GSE是從葡萄籽里提取到的多酚類天然產(chǎn)物，富含黃酮類化合物，主要包括黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)的兒茶素、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯，以及由黃烷-3-醇通過碳-碳鍵結(jié)合聚合而成的原花青素［1］。葡萄籽提取物具有超強(qiáng)的抗氧化能力，能夠有效清除氧自由基，具備抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)血壓等重要功能［2，9-11］，能夠預(yù)防和治療70余種疾病，臨床應(yīng)用廣泛。葡萄籽提取物具有較高的食用安全性，無急性毒性和慢性長期毒性作用，日益被各國廣泛用作營養(yǎng)補(bǔ)充劑來使用。目前關(guān)于葡萄籽的生物活性作用報道較多，但對破骨細(xì)胞影響的研究未見報道，本研究擬探討其對破骨細(xì)胞分化、形成、功能的影響。

在本研究中，我們用100μg∕mL的葡萄籽提取物處理RAW264.7細(xì)胞，并對其用含30 ng∕mL M-CSF、100 ng∕mLRANKL的10%FBSα-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清，利用qPCR檢測破骨細(xì)胞分化標(biāo)志分子的表達(dá)，利用TRAP染色及TRAP活性定量實(shí)驗(yàn)檢測破骨細(xì)胞的形成情況，利用c-TX定量實(shí)驗(yàn)檢測破骨細(xì)胞的骨吸收活性。研究結(jié)果顯示，經(jīng)葡萄籽提取物處理后，破骨標(biāo)志分子Itgb3、Acp5、Dcst、Ctsk mRNA水平均顯著降低，TRAP陽性細(xì)胞數(shù)目減少，TRAP活性顯著降低，c-TX分泌顯著減少，表明葡萄籽提取物有效抑制破骨細(xì)胞分化形成及活性。我們下一步工作將驗(yàn)證葡萄籽提取物在體內(nèi)的作用。若內(nèi)外研究結(jié)果在體內(nèi)得到了驗(yàn)證，將會有力地證明GSE可以作為有效的營養(yǎng)補(bǔ)充劑用于骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療，將豐富目前對于GSE功能的認(rèn)識。

圖2 TRAP染色檢測破骨細(xì)胞形成（TRAP染色×400）：A為對照組，B為GSE處理組，