張鳳久，張麗敏，王宏杰，李海波，王海明，彭向東，楊建玲

0引言

在臨床中，糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是致盲的主要疾病[1]。為此，研究DR的發(fā)病機制、預(yù)后治療手段等，成為臨床普遍關(guān)注的重點。該疾病的發(fā)病機制較為復(fù)雜，影響因素較多?，F(xiàn)階段，在醫(yī)學技術(shù)發(fā)展的新形勢下，細胞學分析疾病的發(fā)病機制，已成為臨床研究熱點[2-3]。光生物調(diào)節(jié)作用，借助低強度淡色光、激光等，對組織或是細胞具有非損傷的調(diào)節(jié)性作用。目前發(fā)光二極管(light emitting diode，LED)作為一種新型光源在醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用迅速發(fā)展，一定功率和能量密度的LED照射能激活靶細胞，發(fā)揮與相干光源類似的生物學效應(yīng)?；诖?，本研究為了明確LED對大鼠高糖視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的光生物調(diào)節(jié)作用，加以探究。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞來源原代大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞(美國Angio-proteomie公司)購自博士德生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器胎牛血清、D-Hanks液、胰蛋白酶、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體、兔抗大鼠p-Akt單克隆抗體、HRP標記山羊抗兔IgG二抗(美國Sigma公司)及其相關(guān)配套試劑、細胞凋亡試劑盒及其相關(guān)配套試劑、流式細胞儀、激光掃描共焦顯微鏡(美國DB公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組原代大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)48h后傳代培養(yǎng)，以5×105/mL的密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)時間為24h，細胞貼壁后使用無血清培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h。根據(jù)實驗方案分組：正常對照組、高糖模型組、發(fā)光二極管照射高糖組。各組均避光靜置于培養(yǎng)箱內(nèi)。高糖細胞模型組培養(yǎng)基葡萄糖濃度及干預(yù)時間采用我們前期研究的結(jié)果：25mmol/L葡萄糖濃度干預(yù)48h[4]。

1.2.2發(fā)光二極管照射本組的細胞在造模48h后開始照射。將細胞放置于培養(yǎng)箱中，采用發(fā)光二極管紅光光源對培養(yǎng)箱中的細胞進行照射，參照相關(guān)文獻[5]具體照射的參數(shù)值為最大功率1W，光源波長600nm，中心光功率密度6.52mW/cm2。光源與細胞要距離至少超過2cm，光斑的直徑為2.0cm，連續(xù)照射時間為350s，12h后再次照射，共計照射次數(shù)為3次。

1.2.3 MTT細胞凋亡實驗檢測各組細胞凋亡率將細胞制成5×105個/mL細胞懸液，按照100μL/孔接種至96孔板，按細胞分組處理各孔細胞，繼續(xù)培養(yǎng)2～6h，直至細胞完全貼附。按體積分數(shù)10%的比例加入MTT工作液，37℃孵育2h，將板中培養(yǎng)基倒掉，每孔加入200μL DMSO，酶標儀檢測490nm波長下吸光度(A490)值，每組設(shè)6個復(fù)孔，重復(fù)測量3次，取平均值。

1.2.4激光共聚焦顯微鏡觀察視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞內(nèi)鈣離子變化Fluo-4/AM負載入細胞：取出培養(yǎng)4d的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞，激光共聚焦培養(yǎng)皿皿底及周圍用DMEM培養(yǎng)液潤洗3～4次，滴加Fluo-4/AM(5μmol/L)與0.02%Pluronic F127的混合溶液。細胞置于37℃恒溫培養(yǎng)，避光，孵育30min；取出后加入少量DMEM培養(yǎng)基覆蓋細胞；用激光共聚焦顯微鏡對鈣離子進行實時檢測。其方法為：用不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基洗滌3次，每次3min后，繼續(xù)穩(wěn)定20min；檢測熒光強度，設(shè)置激發(fā)波長488nm，綠色熒光接收通道BP:500～550nm，紅色熒光接收通道LP>580nm。

1.2.5 Western blot法檢測各組磷酸化絲氨酸-蘇氨酸激酶(P-AKT)蛋白表達收集各組細胞，采用蛋白裂解液冰上振蕩裂解20min。4℃條件下，12000r/min離心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量法測量蛋白質(zhì)量濃度。按比例加入1/4體積的4倍上樣緩沖液，100℃煮沸5min進行變性，4℃條件下，12000r/min離心5min，取上清。按每孔20μg蛋白上樣量，用質(zhì)量分數(shù)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行電泳分離，再用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用質(zhì)量分數(shù)1% BSA封閉后，孵育一抗和相應(yīng)二抗，其中一抗稀釋倍數(shù)均為1∶1000，二抗稀釋倍數(shù)為1∶5000;之后用ECL發(fā)光液及顯影液定影液進行蛋白的顯影定影，最終膠片讀取數(shù)據(jù)，用Image J軟件進行灰度分析。以β-actin為內(nèi)參照，計算各目的蛋白相對表達水平，并計算Akt磷酸化比率。每個樣本設(shè)置6個復(fù)孔，同一樣本重復(fù)測量3次，取平均值。

2結(jié)果

2.1 LED照射對細胞凋亡的影響三組細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=16.891，P<0.01)。正常對照組的細胞凋亡率顯著低于高糖模型組、發(fā)光二極管照射組，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.063，P<0.01；t=10.099，P<0.01)；發(fā)光二極管照射組的細胞凋亡率顯著低于高糖模型組，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.715，P<0.01)，見表1。

2.2 LED照射對細胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響正常對照組中細胞質(zhì)微弱Ca2+熒光染色，呈綠色熒光，細胞核為藍色熒光；高糖模型組中，細胞質(zhì)呈現(xiàn)較強烈的綠色熒光；發(fā)光二極管照射組中，綠色熒光明顯的高于正常對照組，但明顯低于高糖模型組，見圖1，經(jīng)熒光像素分析三組間細胞中內(nèi)Ca2+熒光像素值具有統(tǒng)計學意義(F=15.846，P<0.05)。正常對照組的Ca2+熒光像素值顯著低于高糖模型組、發(fā)光二極管照射組，差異有統(tǒng)計學意義(t=14.577，P<0.01；t=7.900，P<0.01)；且發(fā)光二極管照射組內(nèi)Ca2+熒光像素值顯著低于高糖模型組，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.881，P<0.01)，見表1。

圖1 LED照射對細胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響(×400)

2.3 LED照射對細胞中P-AKT蛋白表達的影響三組細胞中P-AKT蛋白表達明顯不同，差異有統(tǒng)計學意義(F=12.694，P<0.01)。正常對照組的P-AKT蛋白表達高于高糖模型組、發(fā)光二極管照射組，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.114，P<0.01；t=2.773，P=0.014)；發(fā)光二極管照射組的P-AKT蛋白表達高于高糖模型組，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.807，P<0.01)，見表1。

表1 三組間細胞凋亡率和Ca2+濃度變化及P-AKT蛋白表達量比較

3討論

高血糖是DM最基本的病理生理狀態(tài)，在DM血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。高血糖導(dǎo)致的血管滲透性增加，炎癥和內(nèi)皮細胞損傷是DR發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。在DM的進展過程中，高血糖導(dǎo)致慢性微血管損傷，使得約1/10的患者出現(xiàn)增生性DR(proliferative DR， PDR)或糖尿病性黃斑水腫，嚴重威脅患者視力[6]。但針對DR目前仍缺乏有效的治療方法或藥物。通過現(xiàn)階段臨床研究發(fā)現(xiàn)發(fā)光二極管照射方式對一些組織細胞的光生物調(diào)節(jié)作用較為明顯[7-8]。為此，本研究重點分析了發(fā)光二極管的價值。

在本次研究中，通過分析發(fā)光二極管照射對大鼠高糖視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的光生物調(diào)節(jié)作用及其機制，發(fā)現(xiàn)上述照射方式，對光生物調(diào)節(jié)的作用較為顯著。通過對本次研究結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)以模擬的方式，對體外與體內(nèi)高血糖狀態(tài)加以評估，能夠了解到在25mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)基下，可實現(xiàn)對抗凋亡P-AKT蛋白通路的抑制，且對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞鈣穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生較大的影響。一般來說，細胞在人體可能會出現(xiàn)鈣超載情況，此種現(xiàn)象會導(dǎo)致細胞代謝異常[9-10]。多種細胞的生存、凋亡信號，主要是利用P-AKT蛋白信號途徑的抑制進行傳導(dǎo)的。P-AKT蛋白參與到調(diào)節(jié)細胞的分裂活動、分化活動或是凋亡活動中。蘇氨酸激酶是磷酸化絲氨酸的下游靶蛋白，多種細胞因子能夠與受體相結(jié)合，產(chǎn)生P-AKT蛋白亞單位，從而實現(xiàn)對蘇氨酸激酶活化的誘導(dǎo)。在維持細胞正常結(jié)構(gòu)、功能過程中，鈣起到了十分重要的作用。在正常狀態(tài)時，細胞借助系列性的轉(zhuǎn)運機制，可保障患者體內(nèi)低鈣情況。而多種外在因素的影響致使鈣失衡，對細胞膜與線粒體造成的響應(yīng)損傷等，均會在一定程度上加快細胞的不可逆性死亡。而高糖對于P-AKT蛋白信號通路作用的抑制機制，尚需要深入探究。

依據(jù)本研究結(jié)果，發(fā)光二極管照射對大鼠高糖視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的光生物調(diào)節(jié)作用機制加以總結(jié)。其作用機制突出體現(xiàn)為，利用線粒體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)表達的方式，能有效實現(xiàn)光生物的調(diào)節(jié)[11]。通常情況下，對于功能不正常的組織、細胞等，光生物具有一定的調(diào)節(jié)作用。但是，對于正常功能的組織或是細胞來說，光生物調(diào)節(jié)并不能夠起到較好的作用和影響。也就是說，僅在較為特定的狀況下，選擇相對合理的參數(shù)，使細胞康復(fù)作用得以發(fā)揮。發(fā)光二極管是亮度較高、效率較高且壽命較長的固體性光源，具有新穎性。目前，多項研究認為低強度的發(fā)光二極管，光生物調(diào)節(jié)作用較為明顯[12-13]?，F(xiàn)階段對于光生物學的調(diào)節(jié)作用劑量關(guān)系，對于照射的劑量、時間和強度等，均具有明顯的差異。本次研究中結(jié)果顯示，正常對照組的細胞凋亡率顯著低于高糖模型組、發(fā)光二極管照射組，發(fā)光二極管照射組的細胞凋亡率顯著低于高糖模型組。正常對照組的P-AKT蛋白表達高于高糖模型組、發(fā)光二極管照射組，發(fā)光二極管照射組的P-AKT蛋白表達高于高糖模型組?？梢宰C實，低強度的發(fā)光二極管照射，在一定程度上激活了抗凋亡的P-AKT蛋白通路，細胞凋亡數(shù)目有所減少，且細胞膜離子通道得以開啟，可對鈣信號傳導(dǎo)產(chǎn)生直接性的影響。此外，經(jīng)過低強度發(fā)光二極管照射，高糖模型組、正常對照組的差距比較明顯。分析其原因，高糖細胞模型組在照射實驗中，采用的培養(yǎng)基為25mmol/L的葡萄糖，這與我們前期研究工作相一致[4]。

目前，光生物調(diào)節(jié)治療的臨床研究較為廣泛，但是在DR患者治療的應(yīng)用，尚且存在不夠深入現(xiàn)象。本次研究中，通過對低強度發(fā)光二極管照射對大鼠高糖視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞光生物調(diào)節(jié)作用的觀察，可明確高糖對于P-AKT蛋白表達的抑制、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞鈣穩(wěn)態(tài)均具有較大的影響，促使細胞凋亡，激活P-AKT蛋白的同時，可將其看作DR的輔助治療手段。

綜上所述，高糖環(huán)境可有效抑制蘇氨酸激酶通路活性，對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞鈣穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生影響，促使細胞凋亡，低強度的發(fā)光二極管照射可激活蘇氨酸激酶通路，降低高糖引起的細胞凋亡率。