李 震 郭 靈

(1 廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院人體形態(tài)學(xué)教研室,南寧市 530021,電子郵箱：421980848@qq,com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)人體解剖教研室,南寧市 530021)

星形膠質(zhì)細(xì)胞參與許多疾病的病理過程。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白之一,其表達(dá)情況在星形膠質(zhì)細(xì)胞受到刺激時(shí)發(fā)生相應(yīng)的變化,是反映星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活的標(biāo)志物之一[1-3]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷時(shí),星形膠質(zhì)細(xì)胞由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻?yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞[4-5],后者在CNS對(duì)損傷的反應(yīng)中起著重要作用,包括形成瘢痕和清除變性的突觸末梢,此時(shí)GFAP含量也明顯增加。星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元受損時(shí)反應(yīng)性上調(diào)GFAP水平,因此,GFAP可作為研究CNS損傷后膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的一個(gè)客觀指標(biāo)[6-7]。但是目前有關(guān)外周傷害性疼痛刺激是否對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生影響,國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道仍較少。故本研究分析外周傷害性刺激對(duì)大鼠腦和脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的影響,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取30只Wistar 純系雄性大鼠,56日齡,體重180～290 g,由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào):桂檢字(2003)第0005號(hào)],飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在25℃～28℃,通風(fēng)、自然采光。

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：小鼠抗大鼠GFAP單克隆抗體(批號(hào)：20170318)以及親和素-生物素復(fù)合物(avidin-biotin complex,ABC)試劑盒(批號(hào)：20170419)、粉末型二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)(批號(hào)：20170312)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；水合氯醛(分析純，批號(hào)：20130513)購(gòu)自四川成都市科龍化工試劑廠；多聚甲醛(分析純，批號(hào)：20120409)購(gòu)自上海溶劑廠；30%過氧化氫(分析純，批號(hào)：20130611)購(gòu)自重慶川江化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇(分析純，批號(hào)：20110509)購(gòu)自上海振興化工廠；二甲苯(分析純，批號(hào)：20110315)購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；檸檬酸(分析純，批號(hào)：20110318)購(gòu)自天津市化學(xué)試劑一廠；檸檬酸鈉(分析純，批號(hào)：20120513)購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。實(shí)驗(yàn)儀器：江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀(上海川沙花木農(nóng)機(jī)廠)；Leica RM 2253輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；ZHPY型恒溫式附貼切片展片儀(河北醫(yī)學(xué)院)；202-1型電熱干燥箱(上?？h第二五金廠)；CHS型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus光學(xué)有限公司)；AE-240型電子分析天平(Mettler-Toledo儀器有限公司)；BCD-108CT型低溫冰箱(河南新飛電器有限公司)；DG-401型電熱恒溫孵育箱(天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠)；0.25 mm×25 mm無(wú)菌針灸針(北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心)。

1.3 動(dòng)物分組及干預(yù)方法 按隨機(jī)數(shù)字表將30只大鼠分為實(shí)驗(yàn)組(n=18)、假手術(shù)組(n=6)、正常對(duì)照組(n=6),其中實(shí)驗(yàn)組又分1 h組(n=6)、3 h組(n=6)及6 h組(n=6)。實(shí)驗(yàn)組大鼠在清醒狀態(tài)下,用組織鉗迅速打斷大鼠左側(cè)前肢的尺骨、橈骨及右側(cè)后肢的脛、腓骨中段,造成多發(fā)性、閉合性骨折；假手術(shù)組大鼠在清醒狀態(tài)下,用組織鉗輕輕夾取大鼠左側(cè)前肢的尺骨、橈骨及右側(cè)后肢的脛、腓骨中段；正常對(duì)照組大鼠則不予任何刺激處理。

1.4 標(biāo)本獲取 分別在刺激后1 h、3 h、6 h獲取實(shí)驗(yàn)組大鼠的腦和脊髓標(biāo)本。給予3.5%水合氯醛(1.2 mL/100 g體重)腹腔注射進(jìn)行麻醉,快速開胸,經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈,剪開右心耳,快速灌注pH 7.4的生理鹽水100～200 mL,然后按先快后慢次序灌注4%多聚甲醛500 mL(0.1 mol/L 磷酸緩沖液配制,pH 7.4),于30～40 min完成灌注。灌注完畢后,首先去除大鼠顱蓋骨,將大鼠頭部準(zhǔn)確地安置在大鼠腦立體定位儀上,參照大鼠腦立體定位圖譜[8],切取出腦組織(前囟前1.70 mm至前囟后0.92 mm、前囟后0.92 mm至前囟后3.80 mm)各兩塊，此范圍的腦組織包括全部扣帶回皮質(zhì)(cg1)、第一軀體感覺區(qū)、斜角帶以及部分背側(cè)海馬,每塊大小約為3 mm×1.5 cm×1 cm；然后去除大鼠脊柱暴露脊髓,切取脊髓頸膨大(大小為1.5 mm×5 mm×1 mm)和腰骶膨大(2 mm×5 mm×1 mm)。將腦與脊髓組織塊放置于4%多聚甲醛固定液后固定3 h(4℃)后,用自來水沖洗腦組織2～3次,再將所有腦與脊髓組織放于盛有蒸餾水的燒杯中漂洗(30 min/次，6次)；脫水透明：70%乙醇(4 h)→80%乙醇(4 h)→90%乙醇(2 h)→95%乙醇(2 h)→100%Ⅰ乙醇(1.5 h)→100%Ⅱ乙醇(1 h)→100%乙醇與二甲苯1 ∶1溶液(0.5 h)→二甲苯Ⅰ(0.5 h)→二甲苯Ⅱ(0.5 h),此時(shí)組織塊已完全脫水與透明；浸蠟：石蠟Ⅰ(58℃,1 h)、石蠟Ⅱ(58℃,1 h)、石蠟Ⅲ(54℃,過夜)；包埋：鐵板架包埋,蠟塊大小約為2 cm×1 cm×1.5 cm,要求快速冷卻。假手術(shù)組、正常對(duì)照組均與實(shí)驗(yàn)1 h組同時(shí)用相同的方法取材。

1.5 染色方法 在正式進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)前均需將石蠟組織切片常規(guī)脫蠟至水：二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→二甲苯Ⅲ,每步驟各10 min。脫去切片中的石蠟；下行梯度乙醇入水：100%乙醇Ⅱ→100%乙醇Ⅰ→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→60%乙醇→50%乙醇,每級(jí)乙醇脫水5 min以去除二甲苯；雙蒸餾水漂洗10 min(次)，2次,以去除乙醇；磷酸緩沖鹽溶液漂洗5 min(次)，2次,待進(jìn)行相關(guān)的免疫反應(yīng)。

取常規(guī)腦冠狀冰凍切片及脊髓水平冰凍切片,片厚40 μm,將0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)放入微波盒中,用微波爐煮沸后插入已脫蠟至水的組織片進(jìn)行抗原微波修復(fù),將溫度控制在95℃～98℃,修復(fù)1.5 min,自然冷卻至室溫。用0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.4)漂洗2次,5 min/次。室溫下用3%過氧化氫(雙蒸水配制)消除切片內(nèi)源性過氧化物酶催化活性15 min,再用0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次，5 min/次。用正常山羊血清工作液封閉組織中的抗原10 min(37℃),傾去工作酶,勿洗,并保持組織濕潤(rùn)。加入小鼠抗大鼠GFAP單克隆抗體(1 ∶1 000)4℃過夜；然后用0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，5 min/次。加生物素兔抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20170415)(1 ∶200)室溫孵育2 h。0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，5 min/次。加標(biāo)記的卵白素(ABC復(fù)合物)室溫孵育2 h。0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，5 min/次。DAB試劑盒顯色,37℃顯色約2 min,自來水充分沖洗終止顯色反應(yīng)。脫水透明：70%乙醇(4 h)→80%乙醇(4 h)→90%乙醇(2 h)→95%乙醇(2 h)→100%Ⅰ乙醇(1.5 h)→100%Ⅱ乙醇(1 h)→100%乙醇與二甲苯1 ∶1溶液(0.5 h)→二甲苯Ⅰ(0.5 h)→二甲苯Ⅱ(0.5 h)、中性樹膠封片。

選取每只大鼠腦組織前囟前1.2 mm的切片和前囟后3.14 mm的切片,在40倍物鏡×10倍目鏡的光學(xué)顯微鏡下分別觀察和計(jì)數(shù)每張切片的扣帶回皮質(zhì)(cg1)、第一軀體感覺區(qū)、斜角帶和海馬各亞區(qū)CA1、CA2、CA3及齒狀回雙側(cè)視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(單位：個(gè)/視野),然后取雙側(cè)視野的平均數(shù)作為該腦區(qū)的陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的原始數(shù)據(jù)。取脊髓的頸膨大和腰骶膨大水平切片，在10倍物鏡×10倍目鏡定位脊髓后角,在40倍物鏡×10倍目鏡的光學(xué)顯微鏡下分別觀察和計(jì)數(shù)每張切片的左右側(cè)灰質(zhì)后角的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(單位：個(gè)/視野)。陽(yáng)性細(xì)胞為深棕褐色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較用LSD-t法檢驗(yàn),組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠各相關(guān)腦區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量 1 h組大鼠端腦3個(gè)區(qū)域(扣帶回皮質(zhì)、第一軀體感覺區(qū)、斜角帶)、海馬各亞區(qū)(CA1、CA2、CA3)及齒狀回的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均高于其余各組(均P<0.05),3 h組端腦3個(gè)區(qū)域、海馬各亞區(qū)及齒狀回的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均高于6 h組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組(均P<0.05),而6 h組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組的各相關(guān)腦區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1、表2。

表1 5組大鼠端腦3個(gè)區(qū)域GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(x±s,個(gè)/視野)

表2 5組大鼠海馬各亞區(qū)及齒狀回GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(x±s,個(gè)/視野)

2.2 各組大鼠脊髓頸膨大后角GFAP陽(yáng)性細(xì)胞 除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠脊髓頸膨大后角傷側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均高于健側(cè)(均P<0.05)。1 h組大鼠大鼠脊髓頸膨大后角傷側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均高于3 h組、6 h組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組(均P<0.05),3 h組大鼠脊髓頸膨大后角傷側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均高于6 h組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組(均P<0.05),而6 h組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組大鼠脊髓頸膨大后角傷側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。各實(shí)驗(yàn)組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組組大鼠脊髓頸膨大后角健側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表3 5組大鼠頸膨大后角雙側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(x±s,個(gè)/視野)

2.3 各組大鼠脊髓腰骶膨大后角GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的變化 除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠腰骶膨大后角傷側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均高于健側(cè)(均P<0.05)。1 h組大鼠大鼠腰骶膨大后角傷側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均高于3 h組、6 h組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組(均P<0.05),3 h組大鼠腰骶膨大后角傷側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均高于6 h組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組(均P<0.05),而6 h組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組大鼠腰骶膨大后角傷側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；各實(shí)驗(yàn)組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組組大鼠腰骶膨大后角健側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表4。

表4 5組大鼠脊髓腰骶膨大后角雙側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化(x±s,個(gè)/視野)

3 討 論

疼痛在脊髓水平的調(diào)節(jié)和整合一直被認(rèn)為只與脊髓神經(jīng)元及其遞質(zhì)有關(guān),而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為僅對(duì)神經(jīng)元起著支持和營(yíng)養(yǎng)作用,不具有細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞功能。然而,用完全由神經(jīng)元參與的模型卻無(wú)法解釋一些疼痛現(xiàn)象,如獲得性免疫缺陷綜合征、區(qū)域外疼痛、鏡像痛等[9]。有研究表明,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞參與急性疼痛的發(fā)生和維持,激活后參與許多重要的生理功能,如釋放促炎性因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,在急性疼痛的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[10-11]。此外，孫濤等[11]還發(fā)現(xiàn)脊髓灰質(zhì)后角星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化參與了慢性疼痛的發(fā)生與維持。脊髓灰質(zhì)I和Ⅱ?qū)邮羌顾柚猩窠?jīng)結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分最復(fù)雜的區(qū)域,是傷害性信息出入的第一站,主要接受高閾值傷害性感受器的初級(jí)感覺傳入,其中含有大量的突觸球結(jié)構(gòu),相互構(gòu)成各種類型的突觸,在傷害性信息調(diào)節(jié)中起重要作用[13-14]。而脊髓灰質(zhì)第Ⅲ、Ⅳ層相當(dāng)于激素背角固有核所在部位,有很多背角大細(xì)胞,在疼痛感知中起關(guān)鍵作用,被稱為T細(xì)胞(Tract Cell),其接受從背根傳來的外周傷害性刺激,將信息傳遞到腦組織；四肢的神經(jīng)纖維傳入脊髓背角后,終止于背角神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞,而四肢傷害性刺激后的痛覺超敏癥狀與此類纖維及脊髓背角上行投射纖維密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示,大鼠脊髓灰質(zhì)后角中實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓傷側(cè)的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均比健側(cè)的顯著增多(P<0.05),且胞漿著色明顯,細(xì)胞較肥大,這些變化可能是星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活后,其標(biāo)志物GFAP的表達(dá)也顯著升高的結(jié)果。這提示星形膠質(zhì)細(xì)胞有可能與神經(jīng)元共同參與形成回路網(wǎng)絡(luò)連接,對(duì)疼痛進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。此外，在本研究中,大鼠傷側(cè)脊髓后角的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在不同時(shí)間段的表達(dá)存在著差異,具體表現(xiàn)為1 h組>3 h組>6 h組(均P>0.05),說明多發(fā)性閉合性傷害性刺激后1 h,大鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖且功能活躍,而3 h后開始降低,其數(shù)量在6 h后降至更低。

大腦皮層作為感覺整合的最高級(jí)中樞,接受各種感覺傳入信息,并進(jìn)行加工,最終上升到認(rèn)知階段。研究表明,急性疼痛可激活對(duì)側(cè)的腦區(qū),包括大腦軀體感覺區(qū)、前扣區(qū)、前額皮層,提示這些腦區(qū)參與急性疼痛的中樞信息加工[16]。研究證實(shí),神經(jīng)元可塑性變化和中樞敏感化在疼痛的產(chǎn)生和維持中具有關(guān)鍵作用[17-18],但星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用卻少見報(bào)道。因此,本研究對(duì)大鼠相關(guān)腦區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了定量觀察,結(jié)果顯示,1 h及3 h組大鼠的大腦皮質(zhì)、海馬、齒狀回、扣帶回皮質(zhì)的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組與正常對(duì)照組增多(均P<0.05),這些變化可能是由于脊髓后角的神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活后,神經(jīng)沖動(dòng)通過神經(jīng)纖維上行傳導(dǎo)到以上相應(yīng)的腦區(qū)，并激活其中的神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞引起的。本研究中,實(shí)驗(yàn)組大鼠的大腦第一軀體感覺區(qū)、海馬區(qū)、齒狀回、扣帶回皮質(zhì)的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量隨刺激時(shí)間的變化趨勢(shì)與傷側(cè)的脊髓灰質(zhì)后角幾乎相同,即為1 h組>3 h組>6 h組(均P<0.05),這提示腦內(nèi)各區(qū)感覺神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞與脊髓的相互協(xié)作,導(dǎo)致中樞過敏化,從而參與痛覺的發(fā)生、維持、調(diào)節(jié)的過程,故在傷害性信息傳遞模式中,脊髓與相關(guān)腦區(qū)關(guān)系可能發(fā)生相互作用。此外，在信息傳遞中未必只有激活神經(jīng)元興奮后才激活膠質(zhì)細(xì)胞的模式,還可能存在著神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞同時(shí)興奮或者膠質(zhì)細(xì)胞興奮后激活神經(jīng)元的模式,而后兩種模式很有可能是由于傷害性刺激造成星形膠質(zhì)細(xì)胞膜電位的改變，從而通過不同的細(xì)胞連接來影響神經(jīng)元的興奮性實(shí)現(xiàn)的[17]。故神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用，可能在CNS的痛覺信息處理中起著重要作用。

綜上所述,外周傷害性刺激可同時(shí)激活大鼠脊髓灰質(zhì)后角和腦相關(guān)各區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,腦和脊髓相關(guān)區(qū)域GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加。在傷害性信息傳遞模式中,脊髓與相關(guān)腦區(qū)可能相互作用,星形膠質(zhì)細(xì)胞可能與神經(jīng)元一起共同參與形成回路網(wǎng)絡(luò)連接,對(duì)疼痛進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。