米思倩 胡曉霞 張 紅 蔣雅菲 林冠能

(1 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院婦科，南寧市 530021，電子郵箱：msqddyx@163.com；2 武漢大學人民醫(yī)院婦科，湖北省武漢市 430000)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性的生命健康。宮頸癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內的所有惡性腫瘤中排名第四，而在發(fā)展中國家居于第二位，僅次于乳腺癌，是婦女死亡的主要原因[1]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉錄本長度大于200nt的非編碼RNA，參與細胞增殖、遷移、凋亡、侵襲、細胞周期和轉移等。LncRNA在多種腫瘤中表達失調，通過發(fā)揮促癌或抑癌的作用調控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究表明，lncRNA母系表達基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的作用[2]，而有關宮頸癌的研究也報告了類似結論[3-4]。為進一步明確MEG3在宮頸癌發(fā)生與發(fā)展中的作用，本研究檢測宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA MEG3的表達情況，分析其與臨床病理、預后的關系，并探討lncRNA MEG3表達情況對宮頸癌細胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源 收集于2012年7月至2018年12月在我院接受手術治療的68例宮頸癌患者的宮頸癌組織。68例患者中，年齡≥50歲者34例，<50歲者34例；鱗狀細胞癌53例，腺癌15例；腫瘤高分化16例，中分化31例，低分化21例；腫瘤最大直徑>4 cm者21例、≤4 cm者47例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期ⅠB期39例、Ⅱ期21例、Ⅲ期及以上8例；腫瘤浸潤深度占宮頸壁全層的百分比>50% 者40例，≤50%者28例；有淋巴結轉移者19例，無淋巴結轉移者49例；有脈管浸潤者25例，無脈管浸潤者43例；有神經(jīng)浸潤者6例，無神經(jīng)浸潤者62例；癌灶累及子宮及附件者18例，未累及子宮及附件者50例。另取因子宮良性病變切除子宮的30例正常宮頸組織作為對照組。本研究經(jīng)廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過，所有的標本均經(jīng)患者知情同意后留取術中部分標本，由我院病理科醫(yī)生再次復核確認。標本于液氮罐中長期保存。

1.2 細胞系及試劑 人宮頸癌細胞株HeLa、SiHa均購自中國科學院上海細胞庫。細胞培養(yǎng)液RPMI-1640(批號：8117203)及胎牛血清(批號：35081003)購自美國Gibco公司，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline,PBS)(批號：20170803)、胰蛋白酶(批號：20170718)購自索來寶公司，RNA分離試劑TRIzol(批號：190906)、脂質體3000(批號：2015900)購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(批號：25749520)購自美國Roche公司，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master實時熒光定量PCR試劑盒(批號：34226600)購自美國Roche公司。細胞計數(shù)(cell count kit-8,CCK-8)溶液(批號：20180508)購自大連美侖生物技術有限公司，Matrigel基質膠(批號：6235005)購自美國BD公司,結晶紫(批號：201603222)購自索來寶公司，甲醇(批號：2018090701)、無水乙醇(批號：2018012301)購自成都科隆公司。由上海吉瑪公司合成MEG3過表達質粒(pcDNA3.1-MEG3)、空載質粒(pcDNA3.1-NC)以及MEG3 小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)、陰性對照siRNA；MEG3 siRNA序列有義鏈為5′-GCUCAUACUUUGACUCUAUTT-3′，反義鏈為5′-AUAGAGUCAAAGUAUGAGCTT-3′；陰性對照siRNA序列有義鏈為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.3 實時熒光定量PCR檢測組織MEG3 mRNA表達 根據(jù)TRIzol試劑說明書提取受檢組織的總RNA(冰上操作)。使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(Thermo公司)檢測RNA質量，A260/A280在1.8～2.0為合格，于-80℃冰箱儲存。參照反轉錄試劑盒說明書，將獲得的總RNA經(jīng)25℃ 10 min、50℃ 60 min、85℃ 5 min反轉錄為cDNA。以第1條鏈cDNA為模板，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內參，參照實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR擴增。PCR反應體系共20 μL，包括SYBR Premix Ex TapⅡ(2x)10 μL，PCR上游引物(10 μm)0.6 μL，PCR 下游引物(10 μm)0.6 μL，Rox Reference Dye(50x)0.4 μL，dH2O 7.4 μL,cDNA 1.0 μL。反應程序為95℃預變性10 min，95℃ 15 s、64℃ 1 min，共50個循環(huán)。MEG3基因上、下游引物分別為5′-ATCATCCGTCCACCTCCTTGTCTTC-3′、5′-GTATGAGCATAGCAAAGGTCAGGGC-3′；GAPDH基因的上下游引物分別為5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′、5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAG-3′；引物由Primer Bank設計，美國Invitrogen公司合成。采用2-△△Ct法進行分析MEG3基因相對表達量，其中△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組，△Ct=(CtMEG3-CtGAPDH)。

1.4 細胞的培養(yǎng)和轉染 人宮頸癌細胞株HeLa及SiHa細胞在10% 胎 牛 血 清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h后進行實驗。實驗分為兩部分：(1)質粒轉染前1 d，將宮頸癌細胞以每孔適量濃度接種于6孔培養(yǎng)板(SiHa細胞2.8×105個/孔,HeLa細胞2.4×105個/孔)。24 h后細胞貼壁生長匯合至80%～90%，分別設為過表達MEG3組(OE-MEG3組)，空載質粒組(NC 組)，另設無干預的細胞為空白對照組(MOCK組)，按脂質體3000說明書分別轉染MEG3過表達質粒(pcDNA3.1-MEG3)、空載質粒(pcDNA3.1-NC)，并在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)于含2%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，體積為2 mL，轉染時質粒濃度為1 μg/L；轉染6 h后更換為含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)30 h。(2)siRNA轉染前1 d，將宮頸癌細胞以每孔適量濃度接種于6孔培養(yǎng)板(SiHa細胞2.0×105個/孔,HeLa細胞 1.6×105個/孔)。24 h后細胞貼壁生長匯合至30%～40%時，分別設置干擾MEG3表達組(si-MEG3組)及陰性對照組(NC 組)，另設無干預的細胞為空白對照組(MOCK組)，按脂質體3000說明書分別轉染MEG3 siRNA、陰性對照siRNA，在37℃、5% CO2條件下將細胞培養(yǎng)于含2%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，體積為2 mL，轉染時siRNA濃度為40 nmol/L；轉染24 h后更換為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)30 h。

1.5 CCK-8試驗 收集換液培養(yǎng)后30 h的各組細胞，將細胞用0.25%胰蛋白酶消化、離心(室溫，1 000 r/min，3 min)后計數(shù),將重懸后的細胞以3 000個/孔的密度接種于96孔板，每組設置3個復孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待貼壁后分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h、120 h的時間點,取出待測孔加入100 μL 10% CCK-8溶液，并設置調零孔，繼續(xù)培養(yǎng)孵育1.5 h后，37℃恒溫搖床上低速震蕩30 s,在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm波長處測量各孔A值。96孔板每24 h更換含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。實驗重復3次取平均值。

1.6 Transwell遷移實驗 收集轉染后30 h的各組細胞，用無RPMI-1640培養(yǎng)液調整濃度為2×105個/mL，在下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，上室加入150 μL細胞懸液，培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2條件下)培養(yǎng)6～8 h后吸干上室液體，擦去上室底膜表面的細胞，移到預先加入約800 μL甲醇的24孔培養(yǎng)皿孔中，室溫固定30 min后，0.1%結晶紫染液(將50 mg結晶紫粉末溶于10 mL無水乙醇中，此時濃度為0.5%的母液，再以母液與PBS以1 ∶4的體積比配成染液，避光保存)染色20 min，切下底膜，晾干，移至載玻片上，用中性樹膠封片。光鏡下隨機取5個視野，計數(shù)各組穿出的細胞數(shù)。實驗重復3次，取平均值。

1.7 Transwell侵襲實驗 Matrigel基質膠在4℃過夜融化后，用4℃預冷的PBS(或無血清培養(yǎng)基)稀釋Matrigel基質膠(冰上操作)，Matrigel基質膠與PBS的比例為1 ∶3，在上室底部中央垂直加入80 μL稀釋后的Matrigel基質膠,37℃溫育4～5 h使其干成膠狀后吸出培養(yǎng)板中殘余液體。其余步驟同遷移實驗。實驗重復3次，取平均值。

1.8 實時熒光定量PCR檢測細胞MEG3 mRNA表達 取轉染質粒及siRNA后48 h的各組細胞進行檢測。檢測步驟同1.3。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析及作圖。采用Shapiro-Wilk法檢驗計量資料的正態(tài)分布情況，如符合正態(tài)分布，采用(x±s)表示，比較采用t檢驗或方差分析，如不符合正態(tài)分布采用M(Q)表示，比較采用Mann-WhitneyU或Kruskal-WallisH檢驗法；計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，比較采用χ2檢驗，等級資料比較采用Kruskal-WallisH非參數(shù)檢驗法；采用Kaplan-Meier法計算生存時間，比較采用log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MEG3在宮頸癌組織中的表達情況 宮頸癌組織的MEG3 mRNA相對表達量為0.187(0.243)，低于正常宮頸組織的0.999(0.459)(u=-0.716，P<0.001)。

2.2 宮頸癌組織中MEG3的表達與臨床病理參數(shù)、生存時間的關系 以68例患者宮頸癌組織中MEG3 mRNA相對表達量的中位值(0.187)作為表達高低的分界，MEG3低表達34例、高表達34例。MEG3低表達患者的腫瘤分化程度更低、FIGO分期更高，浸潤深度>50%以及淋巴轉移的發(fā)生率均更高(均P<0.05)，見表1。68例患者術后電話隨訪4～64個月(中位隨訪時間為27個月)，其中失訪 9 例、死亡9例、復發(fā) 8例。宮頸癌組織中 MEG3高表達患者的中位生存時間、無瘤生存時間分別為28個月、24個月，分別高于低表達者的20個月、13個月(χ2=4.217，P=0.040；χ2=4.693，P=0.030)，見圖1。

表1 不同MEG3表達量患者的臨床病理參數(shù)比較[n(%)]

圖1 MEG3高、低表達者的生存曲線及無瘤生存曲線

2.3 各轉染組宮頸癌HeLa細胞及SiHa細胞中MEG3 mRNA相對表達量比較 質粒轉染后，MOCK組、NC組及OE-MEG 3組HeLa細胞及SiHa細胞中的MEG3 mRNA相對表達量比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，其中OE-MEG3組的表達量均高于其他兩組(均P<0.05)，而MOCK組、NC組間差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。轉染siRNA后，MOCK組、NC組和si-MEG3組HeLa細胞、SiHa細胞中的MEG3 mRNA相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，其中si-MEG3組的表達量均低于其他兩組(均P<0.05)，而MOCK組、NC組間差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表3。

表2 各質粒轉染組宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞中MEG3 mRNA相對表達量比較(x±s)

表3 各siRNA轉染組宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞中MEG3 mRNA相對表達量比較(x±s)

2.4 轉染質粒后3組宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞的增殖情況及侵襲遷移能力 在培養(yǎng)后24 h，3組HeLa細胞或SiHa細胞的A值差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；自培養(yǎng)后48 h起，OE-MEG3組HeLa細胞或SiHa細胞的A值均低于NC組和MOCK組(均P<0.05)，而MOCK組與NC組差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表4。MOCK組、NC組、OE-MEG3組的HeLa細胞及SiHa細胞侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中OE-MEG3組的細胞侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目均低于其他兩組(均P<0.05)，而MOCK組與NC組差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表5及圖2、圖3。

表4 質粒轉染后3組宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞各時間點增殖情況比較(x±s)

表5 質粒轉染后3組宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞侵襲數(shù)目及細胞遷移數(shù)目比較(x±s，個)

圖2 轉染后3組宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞侵襲能力(×200)

圖3 轉染后3組宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞遷移能力(×200)

2.5 轉染siRNA后3組宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞的增殖情況及侵襲遷移能力 在培養(yǎng)后24 h，3組HeLa細胞或SiHa細胞的A值差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；自培養(yǎng)后48 h起，OE-MEG3組HeLa細胞或SiHa細胞的A值均高于NC組和MOCK組(均P<0.05)，而MOCK組與NC組差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表6。si-MEG3組、NC組及MOCK組的HeLa細胞、SiHa細胞侵襲數(shù)目及遷移數(shù)目差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),其中si-MEG3組的細胞侵襲數(shù)目及遷移數(shù)目均高于其他兩組(均P<0.05)，而MOCK組與NC組差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表7及圖4、圖5。

表6 siRNA轉染后3組宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞各時間點增殖情況比較(x±s)

表7 siRNA轉染后3組宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞侵襲數(shù)目及細胞遷移數(shù)目比較(x±s，個)

圖4 siRNA轉染后3組宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞侵襲能力(×200)

圖5 siRNA轉染后3組宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞遷移能力(×200)

3 討 論

MEG3位于人類染色體14q32.3，為小鼠Glt2基因的同源異型基因，可編碼長度約為1.6 kb的核苷酸，是一種lncRNA[5]。MEG3在許多組織中都有表達，尤其是體細胞中胚層、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、唾液腺上皮、腎臟和胰腺中表達較高，其對生長及發(fā)育有著重要的作用[6-7]。有研究表明，MEG3在多種腫瘤中低表達，如肝癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等，具有抗腫瘤的作用[8-12]。

MEG3在腫瘤中的異常表達與患者的臨床病理特征及預后關系密切[7，13]。例如，在乳腺癌中MEG3表達水平與原發(fā)腫瘤-區(qū)域淋巴結-遠處轉移(tumor-node-metastasis,TNM)分期及淋巴結轉移具有顯著相關性，并且影響患者的預后，可以作為一個潛在的預后標志物[10]；在結直腸腫瘤中，MEG3水平與淋巴結轉移和TNM分期顯著相關，且MEG3低表達的患者總體生存時間較短，可以作為預測患者預后不良的指標[14]；在上皮性卵巢癌中，MEG3低表達與上皮性卵巢癌患者淋巴結轉移相關[15]；在宮頸癌中，MEG3下調水平與腫瘤大小、淋巴結轉移、高危型HPV感染及FIGO分期相關，并且MEG3低表達患者的無復發(fā)生存時間及總生存時間明顯縮短[16]。本研究結果顯示，與正常宮頸組織比較，宮頸癌組織中MEG3 mRNA呈低表達(P<0.05)，且宮頸癌組織MEG3 mRNA低表達者分化程度更低、FIGO分期更高，且深部浸潤>50%及淋巴結轉移發(fā)生率更高，中位生存時間及無瘤生存時間更短(P<0.05)。因此，我們推測MEG3低表達可能與不良預后有關，或可作為評估宮頸癌進展、患者預后的潛在生物標志物。

MEG3的失調可能會引起細胞的功能改變，如MEG3低表達能促進細胞增殖、抑制凋亡、促進血管生成、誘導轉移等[13]。在乳腺癌中，MEG3能抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和血管生成[17]；在肝癌中，MEG3低表達可加速細胞周期，促進肝癌細胞的增殖和侵襲能力[18]；MEG3可以抑制子宮內膜癌細胞及卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，促進細胞的凋亡[11，19-20]；MEG3還能降低膀胱癌及口腔鱗狀細胞癌細胞的侵襲、遷移能力[21-22]。有關宮頸癌的研究顯示，MEG3通過調控Rac1及磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶B/基質金屬蛋白酶2/9信號通路，進而抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲及遷移[4，16]。我們通過在宮頸癌細胞中過表達及下調MEG3表達，發(fā)現(xiàn)在宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞中，OE-MEG3組的細胞增殖能力、細胞侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目均低于其他兩組，而si-MEG3組的細胞增殖能力、細胞侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目均高于其他兩組(均P<0.05)，這提示MEG3過表達能抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力，與上述關于宮頸癌的研究結果相似，提示MEG3在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中作為抑癌基因起作用。

綜上所述，lncRNA MEG3在宮頸癌組織中低表達，這可能與腫瘤的浸潤轉移及不良預后有關；lncRNA MEG3過表達能抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力，其可能作為抑癌基因在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起作用，或可成為判斷宮頸癌預后的生物標志物。然而lncRNA MEG3在宮頸癌中的調控機制還有待進一步研究。