周 容，袁 琦，晉湘宜，張 玉，陳茂彬，方尚玲*

（1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北武漢 430068；2.湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)中心，湖北武漢 430068）

在中國白酒的組成成分中，乙醇和水約占98%～99%，僅有1%～2%為微量成分，而白酒的質(zhì)量和口味就由這部分微量物質(zhì)所決定[1]。由于白酒中微量物質(zhì)的種類和含量的不同[2]，導致中國白酒在香型和風格上差異很大，因此將中國白酒分為濃、清、米、醬、兼等香型[3]。其中濃香型[4]、醬香型[5]、清香型[6]和芝麻香型[7]等白酒中的香味物質(zhì)都被廣泛研究，而有關(guān)兼香型白酒中香味物質(zhì)的分析報道很少。

兼香型白酒是指帶有兩種及以上香型風格特征的產(chǎn)品，是多種香型白酒的綜合感官的協(xié)調(diào)體現(xiàn)。白云邊酒是濃醬兼香型白酒的典型代表，既具有醬香型白酒的幽雅細膩又有濃香型白酒的回味爽凈。然而，目前對兼香型白酒的研究主要集中于大曲、微生物多樣性及功能[8-9]等方面，對其香味物質(zhì)研究很少。

在白酒的前處理技術(shù)中，如攪拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）、液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、同時蒸餾萃?。╯imultaneous distillation extraction，SDE）和頂空-固相微萃?。╤ead space solid-phase micro-extractions，HS-SPME）等技術(shù)都常用于白酒香味物質(zhì)的提取。LLE通常需要有機溶劑[10]，SDE操作時間冗長[11]，SBSE[12]所需成本昂貴且工藝復雜。相比之下，HS-SPME因無溶劑、耗時短、成本低、簡單安全，可以將取樣、富集、解吸和進樣組合成一個步驟等優(yōu)勢而更廣泛地用于白酒香味物質(zhì)的提取[13]。此外，氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀作為一種成熟的檢測器，可以準確快速地分離和確定目標物，已廣泛地應用于白酒行業(yè)揮發(fā)性物質(zhì)的分析[14]。因此，本研究采用HS-SPME結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)，研究兼香型年份酒中揮發(fā)性香味成分含量及其變化，并通過主成分分析（principal component analysis，PCA），比較年份酒之間的差異，以期為兼香型白酒中香味物質(zhì)的分析提供理論與實踐指導，進而探索白酒中香味物質(zhì)的形成機理。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

5種白云邊酒[分別為3年（3 Y），5年（5 Y），12年（12 Y），15年（15 Y）和20年（20 Y）酒精度均為42%vol]：湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司。

丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、3-甲基丁醇等26種標品、乙酸正戊酯（內(nèi)標）、無水乙醇（純度均＞97%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

50/30m DVB/CAR/PDMS萃取纖維：上海安譜實驗科技股份有限公司；85-2A恒溫磁力攪拌器：湖南前沿科技有限公司；DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、7890B-5977B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香味物質(zhì)的提取

準確稱量10 mL稀釋后的酒樣（酒精度14%vol）于30 mL頂空進樣瓶中并密封。在磁力攪拌器中40 ℃平衡20 min后用已老化好的萃取頭在頂空瓶液面上方（1～2 cm）富集20 min。最后在230 ℃的進樣口中解吸5 min并進樣。為防止樣品間相互污染，兩次進樣間萃取頭于240 ℃老化5 min。

1.3.2 GC-MS分析條件

GC條件：以氦氣（He）（純度99.999%）作為載氣，恒定流速為0.7 mL/min，采用不分流模式。柱箱升溫程序為45 ℃保持1.5 min，以6 ℃/min升至85 ℃，不保持，然后以4 ℃/min升至225 ℃，保持15 min。進樣口溫度230 ℃。MS條件：電子電離（electionic ionization，EI）源，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量范圍為30～550 m/z。

將質(zhì)譜解析與美國國家標準技術(shù)研究所（national in stitute of standards and technology，NIST）14譜庫的比對結(jié)果進行初步定性（匹配度＞90%）、再與已有標樣的保留時間來進一步確認化合物結(jié)構(gòu)。采用半定量法計算各物質(zhì)含量。

1.3.3 模擬酒樣的制備

分別取一定量的26種標樣，以無水乙醇為溶劑定容于10 mL容量瓶中，得到標準儲備液；標準儲備液通過梯度稀釋得到標準工作液，上述標樣和溶液均在4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谝掖既芤海ň凭?4%vol）中加入一系列已知濃度的標準工作液制備成模擬酒樣，建立標準曲線進行方法評價。其中檢測限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）分別在3倍和10倍信噪比下計算，向樣品中添加一定量的標準工作液計算回收率。

1.3.4 重要香氣物質(zhì)的確定

通過計算化合物的香氣活度值（aroma activity value，OAV）用來表征各化合物對香氣貢獻的大小。OAV的計算公式為：OAV=物質(zhì)含量/物質(zhì)閾值[15]。

通常認為OAV＞1的化合物對白酒香味有貢獻，而OAV＞10的化合物視為重要香氣物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 酒精度的選擇[16]

本實驗考察了酒精度（7%vol、14%vol、28%vol和42%vol（原酒樣））對香味成分的萃取效果，結(jié)果見圖1。

圖1 酒精度對香味物質(zhì)總數(shù)量和總峰面積的影響Fig.1 Effect of alcohol content on the total quantity of aroma components and total peak area

由圖1可知，從化合物總峰面積和總出峰個數(shù)而言，酒精度為14%vol的酒樣均遠高于其他3種酒精度。表明酒精度對香味物質(zhì)的提取影響很顯著。因此，選擇酒樣最適酒精度為14%vol。

2.1.2 萃取溫度的選擇[17-18]

本實驗對比了萃取溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃）對提取效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 萃取溫度對香味物質(zhì)總數(shù)量和總峰面積的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the total quantity of aroma components and total peak area

由圖2可知，總出峰個數(shù)和總峰面積在30～40 ℃時逐漸上升，并在萃取溫度40 ℃達到最多，但在40～50 ℃迅速下降，到60 ℃時吸附量波動很小。因此，選擇最適萃取溫度為40 ℃。

2.1.3 萃取時間的選擇[19]

本實驗研究了萃取時間為20 min、30 min、40 min和50 min的萃取結(jié)果，結(jié)果見圖3。

圖3 萃取時間對香味物質(zhì)總數(shù)和總峰面積的影響Fig.3 Effect of extraction time on the total quantity of aroma components and total peak area

由圖3可知，萃取時間為20～30 min時，香味成分總數(shù)量和總峰面積隨萃取時間增加而增大，從30 min以后吸附量增長不明顯，說明吸附-解吸過程趨于平衡。因此，選擇最適萃取時間為30 min。

2.1.4 解吸時間的選擇[20]

本實驗對比較了5 min、10 min、15 min和20 min的解吸效果，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著解吸時間從5 min延長到20 min，物質(zhì)的總峰面積和出峰個數(shù)幾乎都沒有增加，說明5 min的解吸時間已經(jīng)足以將吸附物質(zhì)完全解吸出來。考慮到萃取纖維的使用壽命和實驗效率，最佳解吸時間為5 min。

圖4 解吸時間對香味物質(zhì)總數(shù)和總峰面積的影響Fig.4 Effect of desorption time on the total quantity of aroma components and total peak area

綜上，本實驗以酒樣酒精度為14%vol，萃取溫度為40 ℃，萃取時間為30 min，解吸時間為5 min確定為HS-SPME最佳操作參數(shù)。

2.2 方法驗證

通過可能有香氣貢獻的物質(zhì)對優(yōu)化方法進行評價，旨在檢驗該方法的可靠性，結(jié)果見表1。由表1可知，各標樣的線性相關(guān)系數(shù)（R2）除油酸乙酯（0.988 6）和正丁酸（0.986 7）外，其他標樣相關(guān)系數(shù)（R2）均＞0.991 6。LOD和LOQ分別為0.13～18.86 μg/L和0.42～63.59 μg/L，低于文獻報道值[21]。采用標準加入法對方法的回收率進行評價，除2-苯乙醇的加標回收率為77.8%外，其他物質(zhì)的回收率為81.1%～115.3%，大部分都在80%～120%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均＜14.8%，表明此方法準確性和精密度良好，能應用于白酒香味成分分析中。

表1 方法的相關(guān)系數(shù)和線性范圍、定量限和檢測限、回收率和精密度Table 1 Correlation coefficients,linear ranges,LOQ,LOD,recovery rates and RSD of the method

2.3 年份酒的揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

采用已建立的HS-SPME結(jié)合GC-MS法對五種兼香型白酒中揮發(fā)性化合物進行分析，結(jié)果見表2。

由表2可知，共鑒定出67種化合物，包括50種酯類（含量80.25%），3種醇類（含量0.17%），5種酸類（含量19.33%），1種芳香族化合物（含量0.04%），1種含硫化合物（含量0.001%），2種呋喃類（含量0.05%），3種酮類（含量0.05%）和2種醛類（含量0.06%）。從化合物數(shù)量和含量上可以看出，酯類物質(zhì)在兼香型白酒中最豐富，其次為酸類和醇類物質(zhì)，其他物質(zhì)相對較少。

表2 白云邊年份酒中67種風味成分分析結(jié)果Table 2 Analytical results of 67 flavor compounds in Baiyunbian aged Baijiu

續(xù)表

酯類主要呈現(xiàn)出花香和果香，在構(gòu)成各白酒典型性中起著關(guān)鍵作用[22]，其種類和含量是白酒中最豐富的一類家族。兼香型白酒隨著年份的增加酯類含量明顯增加，3Y、5Y、12Y、15Y和20Y總酯含量分別為1598.13mg/L、1743.20mg/L、1 775.40 mg/L、1 808.13 mg/L和1 844.76 mg/L，說明酯類物質(zhì)主要以酯化反應為主。其中己酸乙酯在3Y、5Y、12Y、15Y和20Y年中分別為1449.80mg/L、1547.43mg/L、1511.22 mg/L、1 535.82 mg/L和1 541.67 mg/L，在酯類物質(zhì)中的含量最高。其次為丁酸乙酯和戊酸乙酯，含量分別在62.80～161.42 mg/L和33.98～59.62 mg/L范圍內(nèi)。含量較高的酯類物質(zhì)還有辛酸乙酯（10.05～23.59 mg/L）、己酸己酯（12.91～28.76 mg/L）、庚酸乙酯（7.89～15.23 mg/L）、丁酸乙酯和辛酸乙酯含量隨年份的增加而升高；戊酸乙酯和己酸己酯含量隨年份的增加先升高后降低，且二者都在12 Y中含量最高。

醇類作為白酒中的微量助香劑，使酒體香味獨特，對促進酒體豐滿醇厚和醇甜感濃郁起著關(guān)鍵作用[23]。本次實驗一共檢測出3種醇類物質(zhì)，總醇含量在3 Y、5 Y、12 Y、15 Y和20 Y酒樣中分別為1.86 mg/L、1.23 mg/L、1.51 mg/L、7.95 mg/L和6.33 mg/L。3-甲基丁醇在酒體中含量最高，但僅在12 Y（5.64 mg/L）和15 Y（4.47 mg/L）中檢測出，在白酒發(fā)酵過程中脫氨基和脫羧反應產(chǎn)生的燃燒香味即由3-甲基丁醇產(chǎn)生[24]。此外，2-苯乙醇含量在五個年份酒中穩(wěn)定在1.09～1.94 mg/L，也是白酒中重要的香氣物質(zhì)，2-苯乙醇具有蜜香玫瑰味，使酒體具有清雅香氣和綿甜清爽之感[25]。辛醇含量最少且僅在3 Y、5 Y及15 Y中出現(xiàn)，其含量分別為0.19 mg/L、0.14 mg/L和0.37 mg/L。

酸類是促成白酒香味的主要貢獻者之一，也是酯類的前驅(qū)物質(zhì)。大多數(shù)有機酸是在發(fā)酵過程中由細菌產(chǎn)生[26]。在酒樣中檢測到的總酸含量在3 Y、5 Y、12 Y、15 Y和20 Y酒樣中分別為277.56 mg/L、357.91 mg/L、480.74 mg/L、471.91 mg/L和523.65 mg/L，隨年份的增加呈上升趨勢。正己酸能產(chǎn)生溫和宜人的甜香和奶酪香[27]，其含量在酸類物質(zhì)中最高（275.52～517.03 mg/L），呈增長趨勢。辛酸也呈上升趨勢，含量為1.28～4.98 mg/L。丁酸僅在20Y酒樣中發(fā)現(xiàn)，其含量為1.13 mg/L；而戊酸、庚酸等酸類含量都＜1 mg/L。

呋喃類在我國白酒中報道較多的是糠醛類物質(zhì)，糠醛主要在白酒中產(chǎn)生澀味和焦香[28]。在兼香型白酒中檢測到兩種呋喃類物質(zhì)，5-甲基-2-糠醛除了3 Y外，其他四個酒樣中都有被檢測，其含量分別為0.23 mg/L、0.40 mg/L、0.47 mg/L和0.68 mg/L。己酸糠酯含量隨年份呈上升趨勢，在3 Y、5 Y、12Y、15Y和20Y酒樣中分別為1.10mg/L、1.54mg/L、1.35mg/L、2.38 mg/L和2.48 mg/L。

芳香族化合物具有花香和蜂蜜芳香，其主要形成于原料中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸的降解[29]。如上文已介紹的少量2-苯乙醇的蜜香玫瑰味使酒具有清雅香氣和綿甜清爽之感，在五個樣品中分別檢測出1.67 mg/L、1.09 mg/L、1.51 mg/L、1.94 mg/L和1.86 mg/L。醛類物質(zhì)賦予一種“香、爽”的口感，對白酒獨特性起著重要作用，濃度過高容易產(chǎn)生苦味[30]。與醛類相比較，酮類的香氣更為綿柔細膩，具有花香和果香。苯甲醛具有杏仁和焦糖的氣味，在醛酮類物質(zhì)中含量最高，在3 Y、15 Y和20 Y中分別為1.21 mg/L、2.12 mg/L和1.90 mg/L。

隨著年份的增加，香氣成分從微妙動態(tài)變化到趨于穩(wěn)定，使兼香型白酒濃醬協(xié)調(diào)、芳香優(yōu)雅、綿厚爽甜、圓潤怡長、典型性突出。

白酒香味物質(zhì)濃度并不能判斷其對香氣貢獻程度的大小，而是考察OAV的大小。參考香味化合物閾值[31]，對五種兼香型白酒香味成分進行OAV分析，結(jié)果見表3。由表3可知，己酸乙酯的OAV＞10 000，丁酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯和己酸己酯的OAV＞1 000，己酸、二甲基三硫的OAV＞100，十四酸乙酯、萘的OAV＞10。因此OAV＞10的化合物共9種，視為重要香氣物質(zhì)。其中酯類占絕大部分，是白云邊年份酒中最重要的香氣成分。丁酸-3-甲基丁酯、庚酸乙酯、己酸丁酯、己酸異戊酯、辛酸-3-甲基丁酯、苯乙酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、丁酸、戊酸、辛酸2-壬酮、2-十一酮和壬醛的OAV均＞1，這13種成分視為對酒香味有貢獻。這22種香味物質(zhì)賦予兼香型白酒突出的花香、果香、甜香、醇香等香味，其余物質(zhì)OAV均＜1。

表3 兼香型年份酒中22種香味成分的香氣活度值Table 3 Odor activity values determined for 22 compounds in strong-sauce-flavor aged Baijiu

3 結(jié)論

建立了一種分析兼香型白酒香氣物質(zhì)的HS-SPME的方法，最佳萃取條件為酒樣酒精度14%vol，萃取溫度40 ℃，萃取時間30 min，解吸時間5 min。LOD和LOQ范圍分別為0.13～18.86 μg/L和0.42～63.59 μg/L，大多數(shù)物質(zhì)的回收率為81.1%～115.3%，RSD均＜14.8%。

在五種兼香型白酒中共鑒定出67種揮發(fā)性風味化合物，其中酯類、醇類、酸類和呋喃類總含量呈現(xiàn)上升趨勢，芳香類物質(zhì)呈現(xiàn)先上升后略有下降趨勢，醛類、酮類化合物含量變化規(guī)律不明顯。隨著年份的增加，香氣成分從微妙動態(tài)變化到趨于穩(wěn)定，使兼香型白酒濃醬協(xié)調(diào)、芳香優(yōu)雅、綿厚爽甜、圓潤怡長、典型性突出。

確定出22種（OAV＞1）具有香味貢獻的物質(zhì)，其中有9種為重要的香氣成分（OAV＞10），這22種香味物質(zhì)賦予兼香型白酒突出的花香、果香、醇香、甜香等香味。為進一步分析兼香型白酒香味物質(zhì)提供理論與實踐指導，進而探索白酒中香味物質(zhì)的形成機理，對今后白酒的釀造生產(chǎn)，穩(wěn)定并提高年份酒產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的意義。