黃國昌，金丹鳳，邱小忠，熊大維

（江西省科學(xué)院微生物研究所，江西南昌 330096）

隨著人們對新型天然生物保鮮劑需求的增加，苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）因其具有寬廣的抑菌譜，能抑制多種食源性致病菌（包括引起食品腐敗的大部分細(xì)菌和真菌），且其溶解性好、對酸堿和熱穩(wěn)定性強(qiáng)，成為了人們研究的熱點(diǎn)[1-5]。此外，苯乳酸近年還被發(fā)現(xiàn)作為新型生物相容性的單體，用于工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域合成重要的藥物[6-7]。然而目前苯乳酸發(fā)酵水平明顯不能滿足市場的需求，通過菌種改造、培養(yǎng)基優(yōu)化、工藝優(yōu)化等手段來提高產(chǎn)量是苯乳酸發(fā)酵研究的重點(diǎn)。

自1998年DIEULEVEUX V等[8-9]確定苯乳酸是白地霉（Geotrichum candidum）產(chǎn)生的主要抑菌物質(zhì)以來，人們在苯乳酸發(fā)酵產(chǎn)量的提高方面做了大量的研究。楊小院等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，微膠囊化細(xì)胞和添加外源4,5-二羥基-2,3-戊二酮可增加自誘導(dǎo)子AI-2的表達(dá)及提高群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）能力，有利于提高苯乳酸的產(chǎn)量，并通過對發(fā)酵條件優(yōu)化提高苯乳酸的產(chǎn)量。李興峰等[12-13]利用泡菜中篩選得到的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）SK007，并優(yōu)化了補(bǔ)料發(fā)酵、靜息細(xì)胞和滲透化細(xì)胞轉(zhuǎn)化等工藝。李芬等[14-15]通過對植物乳桿菌LY-78進(jìn)行誘變、培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化來提高苯乳酸產(chǎn)量。ZHENGZ J等[16]將篩選得到嗜熱苯乳酸生產(chǎn)菌Bacillus coagulansSDM，在50 ℃條件下利用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成苯丙氨酸。另有一些學(xué)者通過構(gòu)建重組基因工程菌的方法來提高苯乳酸的生產(chǎn)能力，ZHU Y B等[17]利用一些小的疏水基團(tuán)替代戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）中D-乳酸脫氫酶（D-lactate dehydrogenase，D-LDH）的Tyr52基團(tuán)，并通過全細(xì)胞催化在Escherichia coliBL21中過表達(dá)來提高苯乳酸的產(chǎn)量。

本研究從不同的環(huán)境中采用改良的菌種篩選方法分離得到2株苯乳酸高產(chǎn)菌株[18]，為進(jìn)一步提高苯乳酸發(fā)酵產(chǎn)量，采用響應(yīng)面法[19]（response surface method，RSM）對植物乳桿菌（L.plantarum）BLPC002發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，旨在為后續(xù)苯乳酸發(fā)酵放大試驗提供思路和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLPC002：本實(shí)驗室篩選保藏。

1.1.2 試劑

培養(yǎng)基各組分：生工生物工程（上海）股份有限公司；苯乳酸、苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：美國SIGMA公司；甲醇、三氟乙酸（均為色譜純）：德國MERCK公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

保藏培養(yǎng)基（MRS瓊脂培養(yǎng)基）：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸粉10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，醋酸鈉5.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，MnSO4·7H2O 0.05 g/L，瓊脂20.0 g/L，蒸餾水1.0 L，pH6.2，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：苯丙氨酸4.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸粉5.0 g/L，酵母浸粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，醋酸鈉5.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·7H2O 0.25 g/L，吐溫80 1.0 g/L，蒸餾水1.0 L，pH6.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695 Alliance 高效液相色譜儀：美國Waters公司；SW-CJ-2FD雙人凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZWY-2102C恒溫?fù)u床：上海智誠分析儀器制造有限公司；NCMY40超純水機(jī)：重慶隆暾科技有限公司；Biostat A全自動發(fā)酵罐：德國賽多利斯集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵液中苯乳酸的檢測方法

發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心5 min和0.22 μm濾膜過濾后，采用Waters e2695 Alliance 高效液相色譜分離單元和Waters 2489 UV/Vis檢測器進(jìn)行分析。參考黃國昌等[20]的方法，色譜柱：Waters Symmetry? C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10.0 μL，流速：1.0 mL/min，流動相：A相為0.05%三氟乙酸甲醇溶液（V/V），B相為0.05%三氟乙酸溶液（V/V），洗脫程序：0～20 min為A∶B由10%線性變化為100%，20～23 min為100%A相，23～25 min保持A∶B為10%，檢測波長：210 nm。

1.3.2 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：取斜面保藏菌種1環(huán)接入滅菌后的MRS培養(yǎng)基中，裝液量為200 mL/500 mL，30 ℃、100 r/min搖床培養(yǎng)24h，備用。

發(fā)酵培養(yǎng)：以3%的接種量吸取種子液接入滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶裝液量為30 mL/100 mL，30 ℃、100 r/min搖床厭氧培養(yǎng)48 h。

1.3.3 單因素試驗

（1）氮源優(yōu)化單因素試驗：以改良MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在添加苯丙氨酸的情況下，每組試驗分別缺少一種氮源，進(jìn)行單因素試驗，考察牛肉浸粉、蛋白胨、酵母浸粉對苯乳酸產(chǎn)量的影響。另外，在其他組成不變的情況下，考察了作為底物的苯丙氨酸、牛肉浸粉及酵母浸粉添加量對苯乳酸產(chǎn)量的影響。

（2）碳源優(yōu)化單因素試驗：分別以20.0 g/L添加量的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和麥芽糖為唯一碳源，加入改良MRS培養(yǎng)基其他成分及苯丙氨酸，考察不同碳源對苯乳酸產(chǎn)量的影響。另外，在其他組成不變的情況下，單獨(dú)考察了最佳碳源添加量對苯乳酸產(chǎn)量的影響。

（3）其他因子單因素試驗：以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在添加苯丙氨酸的情況下，分別缺少磷酸氫二鉀、硫酸錳、硫酸鎂、醋酸鈉和吐溫80中的一種因子進(jìn)行單因素試驗，考察各因子對苯乳酸產(chǎn)量的影響。

1.3.4 Plackett-Burman試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.7軟件選擇Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計從苯丙氨酸、牛肉浸粉、酵母浸粉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、硫酸錳、吐溫80中篩選出對苯乳酸產(chǎn)量影響顯著的因素。每個因素選取高低2個水平，高水平約為低水平值的1.5倍，每組3個平行試驗，培養(yǎng)48 h后檢測發(fā)酵液中苯乳酸含量（Y）。PB試驗因素及水平見表1。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化Plackett-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design for fermentation medium formula optimization

1.3.5 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，對影響顯著的因素設(shè)定合適的步長和變化方向，正效應(yīng)因素水平增加，負(fù)效應(yīng)因素水平降低，使影響顯著因素水平快速經(jīng)濟(jì)逼近最佳區(qū)域，為下一步響應(yīng)面優(yōu)化試驗確定中心點(diǎn)。

1.3.6 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗

以最陡爬坡試驗苯乳酸產(chǎn)量最高組對應(yīng)的顯著影響因素水平為中心點(diǎn)，采用Box-Behnken（BB）試驗設(shè)計方法，以苯乳酸產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)指標(biāo)，進(jìn)行3水平試驗，確定各影響因素的最佳水平，得到最優(yōu)培養(yǎng)基組成。BB試驗因素水平及其編碼見表2。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation medium formula optimization

1.3.7 統(tǒng)計分析

運(yùn)用Design Expect 8.0.7軟件對回歸模型進(jìn)行方差分析和可靠性分析，并對最大響應(yīng)值及各因素的最佳編碼值進(jìn)行預(yù)測和驗證試驗，得出植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLPC002產(chǎn)苯乳酸的最佳培養(yǎng)組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同氮源對苯乳酸產(chǎn)量的影響

以改良MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加4.0 g/L苯丙氨酸，每組試驗分別缺少一種氮源，并以改良MRS培養(yǎng)基+4.0 g/L苯丙氨酸作為對照，每組試驗重復(fù)3次，配比及試驗結(jié)果見表3。由表3可知，缺少蛋白胨的試驗組與對照組苯乳酸產(chǎn)量幾乎相同；在不添加牛肉浸粉的情況下，苯乳酸產(chǎn)量有所提高；而缺少酵母浸粉時的苯乳酸產(chǎn)量最低，由此初步判斷，蛋白胨對苯乳酸的代謝過程無明顯影響，而牛肉浸粉和酵母浸粉對苯乳酸產(chǎn)量均存在影響，作為下一步篩選苯乳酸產(chǎn)量主要影響的因素。

表3 不同氮源對苯乳酸產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources on the yield of phenyllactic acid

進(jìn)一步對牛肉浸粉、酵母浸粉和苯丙氨酸添加量對苯乳酸產(chǎn)量的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖1。由圖1可知，當(dāng)牛肉浸粉添加量為3.0 g/L時，苯乳酸產(chǎn)量最高，隨著牛肉浸粉添加量增加，苯乳酸產(chǎn)量出現(xiàn)下降趨勢；隨著酵母浸粉添加量逐漸增加，苯乳酸產(chǎn)量有所增加，當(dāng)酵母浸粉添加量達(dá)到3.0 g/L以上時，苯乳酸產(chǎn)量無明顯變化；苯丙氨酸添加量＜4.0 g/L時，苯乳酸產(chǎn)量呈增加趨勢，在4.0～5.0 g/L時，呈緩慢增加，隨后呈緩慢下降趨勢。進(jìn)行Plackett-Burman試驗時，選擇牛肉浸粉3.0 g/L為低水平，選擇酵母浸粉3.0 g/L為高水平，選擇苯丙氨酸4.0 g/L為低水平。

圖1 不同氮源添加量對苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different nitrogen sources addition on the yield of phenyllactic acid

2.1.2 不同碳源對苯乳酸產(chǎn)量的影響

不同碳源及最適碳源添加量對苯乳酸產(chǎn)量的影響如圖2、圖3所示。由圖2可知，以葡萄糖為唯一碳源時，苯乳酸產(chǎn)量最高，約為其他碳源的2倍以上，因此選擇葡萄糖作為植物乳桿菌BLPC002發(fā)酵苯乳酸的碳源。由圖3可知，當(dāng)葡萄糖添加量＜20.0 g/L時，隨著葡萄糖的增加，苯乳酸產(chǎn)量增加明顯，當(dāng)葡萄糖添加量＞20.0 g/L時，苯乳酸產(chǎn)量增長緩慢。故選擇葡萄糖添加量20.0 g/L為低水平進(jìn)行Plackett-Burman試驗。

圖2 不同碳源對苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on the yield of phenyllactic acid

圖3 葡萄糖添加量對苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of glucose addition on the yield of phenyllactic acid

2.1.3 其他因子對苯乳酸產(chǎn)量的影響

考察了磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、酸酸鈉、硫酸錳、硫酸鎂和吐溫80對苯乳酸產(chǎn)量的影響，以改良MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加4.0 g/L苯丙氨酸，每組試驗分別缺少其中一個因素，并以改良MRS培養(yǎng)基+4.0 g/L苯丙氨酸作為對照，每組試驗做3個平行試驗，結(jié)果取平均值，試驗方案及結(jié)果如表3所示。由表3可知，檸檬酸氫二銨、醋酸鈉和硫酸鎂對苯乳酸的產(chǎn)量沒有明顯的影響，且與對照組接近，而磷酸氫二鉀、硫酸錳和吐溫80對苯乳酸的產(chǎn)量產(chǎn)生了較明顯的影響，因此將磷酸氫二鉀、硫酸錳和吐溫80作為下一步篩選影響苯乳酸產(chǎn)量的因子。

表4 其他因子對苯乳酸產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of other factors on the yield of phenyllactic acid

磷酸氫二鉀、硫酸錳和吐溫80的添加量對苯乳酸產(chǎn)量的影響見圖4。由圖4可知，磷酸氫二鉀添加量2.0 g/L時苯乳酸產(chǎn)量最高，硫酸錳添加量0.2～0.3 g/L時苯乳酸產(chǎn)量接近最大，吐溫80添加量1.0～1.5 mL/L時苯乳酸產(chǎn)量最高，故選擇添加量分別為磷酸氫二鉀2.0 g/L、硫酸錳0.25 g/L、吐溫80 1.5 mL/L為高水平進(jìn)行Plackett-Burman試驗。

圖4 磷酸氫二鉀、硫酸錳、吐溫80添加量對苯乳酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of K2HPO4,MnSO2 and tween 80 addition on the yield of phenyllactic acid

2.2 苯乳酸產(chǎn)量顯著影響因子的篩選

Plackett-Burman試驗結(jié)果見表5。利用DesignExpert 8.0.7軟件對表3的試驗結(jié)果進(jìn)行回歸性分析，得到各因素的偏回歸系數(shù)和影響顯著性見表6。由表5、表6可知，苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖添加量對苯乳酸產(chǎn)量影響顯著，其中苯丙氨酸和葡萄糖為正效應(yīng)，牛肉浸粉為負(fù)效應(yīng)，作為下一步進(jìn)行爬坡試驗的依據(jù)。

表5 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of Plackett-Burman experiments

表6 Plackett-Burman試驗設(shè)計影響因素顯著性及效應(yīng)分析Table 6 Significance and effect analysis of influence factors in Plackett-Burman experimental design

2.3 最陡爬坡試驗結(jié)果

表7 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Design and results of the steepest ascent experiments

根據(jù)Plackett-Burman試驗分析的結(jié)果，選取苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖3個因素進(jìn)行最陡爬坡試驗，苯丙氨酸和葡萄糖為正方向，爬坡起點(diǎn)分別為6.0 g/L和20 g/L，步長分別為1.0 g/L和5.0 g/L，牛肉浸粉為負(fù)方向，爬坡起點(diǎn)為3.0 g/L，步長為0.5 g/L。其他因子根據(jù)影響貢獻(xiàn)率大小，分別選取高低水平。試驗設(shè)計及結(jié)果見表7。由表7可知，隨著苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖添加量的變化，苯乳酸產(chǎn)量先升后降，當(dāng)三者添加量分別為8.0 g/L、2.0 g/L和30.0 g/L時，苯乳酸產(chǎn)量最高，達(dá)到1.322 g/L，以此添加量作為中心點(diǎn)，進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗。

2.4 Box-Behnken試驗設(shè)計及培養(yǎng)基組成優(yōu)化結(jié)果

以最陡爬坡試驗結(jié)果為依據(jù)，進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計，試驗結(jié)果如表8所示。試驗數(shù)據(jù)用Design Expect 8.0.7軟件進(jìn)行回歸分析后，擬合得到以下回歸方程：

表8 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 8 Design and results of Box-Behnken experiments

運(yùn)用Design Expect 8.0.7軟件對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表9。由表9可知，A、B、AB、BC、A2、B2和C2項的P值都小于0.05，其對結(jié)果有極顯著或顯著影響，且模型F值為32.71、P值為0.000 6＜0.05，表明回歸模型是顯著的，失擬項F值為3.25，P值為0.244 1＞0.05，表明模型失擬項不顯著，因此，回歸模型是高度顯著的，各試驗因子對響應(yīng)值的影響呈二次拋物面關(guān)系。該模型Mean（響應(yīng)值）=1.567，即苯乳酸產(chǎn)量的均數(shù)為1.567 g/L，R2（相關(guān)性決定系數(shù)）=98.33%，即由苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖及其二次項所確立的模型能解釋苯乳酸產(chǎn)量變化的98.33%，R2Adj（校正相關(guān)性決定系數(shù)）=95.32%，表明該模型的預(yù)測值和實(shí)測值擬合良好，可以很好地解釋響應(yīng)值的變化情況，回歸方程給該菌株發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸提供了一個合適的模型。

表9 回歸模型方差分析Table 9 Variance analysis of the regression model

根據(jù)回歸分析的結(jié)果，運(yùn)用Design Expert 8軟件作出模型的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，如圖5所示，三維響應(yīng)曲面圖和二維等高線圖是回歸方程的圖形解釋形式，可以直觀地顯示各因素之間的相互作用和最大響應(yīng)值對應(yīng)的各因素最佳水平，曲面越明顯表示響應(yīng)值在試驗設(shè)計水平范圍內(nèi)存在極值，變量對應(yīng)的水平為等高線最小橢圓的中心點(diǎn)，等高線表示因素間的交互作用及影響的顯著性，等高線圖呈明顯的橢圓形表示因素間的交互作用明顯，等值線密度越大，表示該因素影響越顯著。

圖5 各因素交互作用對苯乳酸產(chǎn)量響應(yīng)的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the yield of phenyllactic acid

2.5 最佳培養(yǎng)基成分的預(yù)測

通過對回歸方程各自變量求極值，得到回歸模型預(yù)測的最佳編碼值為A=0.147 5，B=-0.167 5，C=-0.0095，即苯丙氨酸8.295 g/L，牛肉浸粉1.832 5 g/L，葡萄糖29.952 5 g/L。此時，苯乳酸產(chǎn)量最大預(yù)測值為1.674 1 g/L?？紤]到實(shí)際操作需要，確定最佳培養(yǎng)基添加量分別為苯丙氨酸8.3 g/L，牛肉浸粉1.8 g/L，葡萄糖30.0 g/L。在此條件下苯乳酸產(chǎn)量為1.67 g/L。

2.6 驗證試驗

為驗證模型的可靠性和預(yù)測最大值，用上述最佳培養(yǎng)基配方進(jìn)行5次平行驗證試驗，苯乳酸平均產(chǎn)量為1.67 g/L，與預(yù)測值非常接近，說明該模型能準(zhǔn)確反映各因素的變化與PLA產(chǎn)量之間的關(guān)系，該模型的設(shè)計具有可靠性。

3 結(jié)論

通過對植物乳桿菌BLPC002發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后，苯乳酸產(chǎn)量達(dá)到1.67 g/L，比優(yōu)化前的0.358 g/L提高了4.6倍；通過單因素試驗、響應(yīng)面法試驗設(shè)計及回歸模型方差分析，篩選出了對苯乳酸產(chǎn)量具有顯著影響的3個因素，分別為苯丙氨酸、牛肉浸粉和葡萄糖，確定了三者最佳添加量分別為8.3 g/L、1.8 g/L、30.0 g/L，苯乳酸產(chǎn)量為1.67 g/L，并通過驗證試驗，苯乳酸產(chǎn)量與預(yù)測值非常接近，表明該模型的設(shè)計具有可靠性。