蔣豐嶺，周瑋忻，伍梓汐，程如越，沈 曦，李 鳴，張 明，陳歷水，劉 蕾，何 方*

（1.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川成都 610041；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048；3.中糧營養(yǎng)健康研究院食品研發(fā)中心，北京 100020）

研究表明，長期過量飲酒會導(dǎo)致腸道菌群紊亂，肝臟功能受損[3]。在酒精性肝硬化的患者腸道內(nèi)，顫螺旋菌屬[4-6]疣微菌屬[4-5，7]等有益菌數(shù)量降低，而腸桿菌屬等致病菌數(shù)量增多[4-7]。酒精及其分布在血液中的代謝物能夠破壞腸粘膜屏障[8]，增加腸道通透性，并且通過門靜脈進(jìn)入肝臟，對肝細(xì)胞造成直接損傷。與此同時，增加了腸源性有害物質(zhì)如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的量，激活受體產(chǎn)生炎性因子和趨化因子[9-16]，在肝臟產(chǎn)生炎性反應(yīng)造成肝臟損害。然而，適量飲酒能夠減少機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，降低高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)病風(fēng)險[17]，并且能夠有效降低癡呆的發(fā)病風(fēng)險[18]。有研究表明，黃酒的使用可以改善慢性應(yīng)激大鼠腸道菌群的紊亂，增加乳酸菌等腸道益生菌的含量，并且減少致病菌或條件致病菌，有利于維持腸道微生態(tài)的平衡，對腸道微生物的組成具有一定的調(diào)控作用[19]。本研究旨在探究低濃度酒精以及同樣酒精度的黃酒對小鼠肝臟和腸道功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒（酒精度為19.55%vol）：北京中糧集團(tuán)有限公司，于4 ℃保存?zhèn)溆茫谎荷笜?biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒：長春匯力生物技術(shù)有限公司；無水乙醇：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；糞便細(xì)菌總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京天根生化科技北京有限公司；Phusion Hot start flex 2X Master Mix：NEB，M0536L；16S rRNA的V3-V4區(qū)引物（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' 和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）：上海生工生物工程股份有限公司；Beckman Agencourt AMPure XP beads：美國Beckman公司；Qubit試劑盒：美國Invitrogen公司；VAHTSTMLibrary Quantification Kit for Illumina?：美國Kapa Biosciences公司。

實(shí)驗(yàn)動物：購于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物研究所[許可證號：SYXK（川）2013-15]的24只4周齡雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量為18～20 g。飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，自由飲水飲食，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境喂養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

Chemray 240全自動生化分析儀：深圳雷杜生命科技有限公司；752型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物處理

24只四周齡雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為3個組（對照組、酒精組、黃酒組），每組8只。對照組灌胃生理鹽水；酒精組灌胃酒精，酒精絕對劑量根據(jù)中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量（2013年版）成人（60 kg）的酒精每日最高攝入量（30 g）進(jìn)行換算，為17.5 mg；黃酒絕對劑量以相同的方式進(jìn)行換算，為89.51 mg。每只小鼠每天灌胃溶液量為0.2 mL，連續(xù)灌胃30 d。

1.3.2 臟器系數(shù)測定方法

使用電子天平測量肝臟的質(zhì)量和小鼠體質(zhì)量。臟器系數(shù)計(jì)算公式如下：

1.3.3 血液生化指標(biāo)測定

根據(jù)試劑盒進(jìn)行操作，采用全自動生化儀檢測血清中肝臟功能相關(guān)指標(biāo)ALT、AST的表達(dá)。

1.3.4 糞便DNA提取

收集小鼠糞便后，-80 ℃凍存。使用糞便細(xì)菌總DNA提取試劑盒提取DNA。每組小鼠所有收集到的糞便樣品均勻混合成5個樣，以反映所有受試小鼠的腸道菌群變化。

1.3.5 二代測序

二代測序由成都貝斯拜爾生物科技有限公司完成。引物5'末端添加特定的標(biāo)記barcode和通用引物。在總體積為25 μL的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系中包含50 ng模板DNA，12.5 μL Phusion Hot start flex 2×Master Mix，2.5 μL正向引物338F 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和反向引物806R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'，用ddH2O調(diào)節(jié)體積。PCR條件為98 ℃初始變性30 s，在98 ℃進(jìn)行35次變性10 s，在54 ℃退火30 s，在72 ℃延伸45 s，然后在72 ℃持續(xù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)，用AMPure XT beads純化，然后用Qubit試劑盒定量。制備擴(kuò)增子池進(jìn)行測序，并分別在Agilent 2100生物分析儀和Library Quantification試劑盒評估擴(kuò)增子庫的大小和數(shù)量。將PhiX Control library（v3）（Illumina）與擴(kuò)增子文庫（預(yù)期為30%）混合測序。通過Illumina MiSeq Instrument對使用標(biāo)準(zhǔn)Illumina測序引物的300 bp配對末端方案對文庫進(jìn)行測序。用bcl2fastq（v1.8.4）和FLASH 軟件（v1.2.11）對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，利用QIIME v1.9.1進(jìn)一步分析序列。首先，使用使用de novo Uchime（usearch v9.0.2132_i86linux32）篩選出良好序列。使用de novo UCLUST算法將最終的良好序列以97%的相似性聚類為可操作分類單（operational taxonomic units，OTU），使用Greengenes數(shù)據(jù)庫（版本13.8）進(jìn)行分類分配，使用PyNAST（v1.2.2）軟件進(jìn)行多序列比對，再用qiime腳本計(jì)算α-多樣性指數(shù)（Ace、Chao1、Shannon、Simpson、PD_whole_ tree），使用Phyloseq package（v1.20.0）來分析β-多樣性（unweighted UniFrac）。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

使用Graphpad prism7.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對于服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）形式來表示數(shù)據(jù)結(jié)果，應(yīng)用單因素方差分析對多組獨(dú)立樣本進(jìn)行比較。對于不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用[中位數(shù)（四分位數(shù)間距）的形式表示，利用Kruskal-Wallis非參數(shù)分析對多組獨(dú)立樣本進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 體質(zhì)量和臟器系數(shù)

表1 體質(zhì)量和肝臟系數(shù)測定結(jié)果Table 1 Determination results of body mass and liver coefficient

由表1可知，在實(shí)驗(yàn)過程中，各組小鼠之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組小鼠之間肝臟系數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果顯示，受試酒精和黃酒未顯著地影響受試小鼠發(fā)育。

2.2 生化指標(biāo)

表2 血液生化項(xiàng)目測定結(jié)果Table 2 Determination results of biochemical indicators of blood

由表2可知，黃酒組、酒精組小鼠ALT含量顯著低于對照組（P＜0.05）。三組間小鼠AST含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但相對于對照組小鼠，酒精組和黃酒組AST含量有下降趨勢，AST與ALT的比值有升高的趨勢。ALT和AST是判斷肝細(xì)胞受損的重要指標(biāo)[20]。有文獻(xiàn)指出，酒精性肝炎的患者AST和ALT均顯著升高[21]。本研究為了探討飲用酒精及含有相同酒精含量的黃酒對宿主肝臟功能的影響，按照中國居民膳食指南的受試酒精和黃酒酒精飲用標(biāo)準(zhǔn)投用受試小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠ALT顯著降低，而小鼠AST也有降低的趨勢。這些結(jié)果表明受試酒精濃度下的酒精和黃酒尚未造成受試小鼠肝功能的損傷，但長期投用可能會造成肝功能損傷。

2.3 二代測序

2.3.1α-多樣性

由表3可知，Ace、Chao1以及PD_whole_tree指數(shù)顯示的結(jié)果均為黃酒組顯著低于對照組和酒精組。Shannon和Simpson結(jié)果顯示三者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 alpha多樣性指數(shù)測定結(jié)果Table 3 Determination results of alpha-diversity indexes

2.3.2 腸道菌群群落組成

圖1 門水平微生物群落組成情況Fig.1 Composition of microbial communities at the phylum level

圖1和表4反映了門水平腸道菌群群落組成情況，擬桿菌門（Bacteroides）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）為三組中相對豐度排前5位的優(yōu)勢菌。對照組Proteobacteria平均相對豐度高于酒精組和黃酒組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖2 屬水平微生物群落組成情況Fig.2 Composition of microbial communities at the genus level

表4 門水平優(yōu)勢菌的平均相對豐度Table 4 Average relative abundance of dominant bacteria at the phylum level

表5 屬水平優(yōu)勢菌的平均相對豐度Table 5 Average relative abundance of dominant bacteria at the genus level

圖2和表5反映了屬水平腸道菌群群落組成情況，顫螺菌屬（Oscillospira）、普雷沃菌屬（[Prevotella]）、擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃菌屬（Prevotella）、臭桿菌屬（Odoribacter）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、低嗜鹽細(xì)菌屬（Dehalobacterium）是三組中相對豐度在前8位的優(yōu)勢菌屬。其中，黃酒組的Ruminococcus和[Prevotella]的相對豐度在三組中最高。對照組與酒精組Oscillospira、Ruminococcus的平均相對豐度上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，二者均為對照組低于酒精組（P＜0.05）。對照組與黃酒組相比，Ruminococcus平均相對豐度水平低于黃酒組。從圖2可以看出，黃酒組和酒精組中嗜單胞菌屬（Stenotrophomonas）的含量明顯減少。

圖3為基于unweighted unifrac距離的主坐標(biāo)軸分析，將影響群落構(gòu)成的最主要的兩個特征值作為橫縱坐標(biāo)，坐標(biāo)軸中的每一個點(diǎn)代表一個樣本，每種顏色代表同一組，當(dāng)同種顏色的點(diǎn)距離越近，不同顏色的點(diǎn)距離越遠(yuǎn)時，代表組間菌群組成具有明顯差異，且這種差異具有一定的穩(wěn)定性。由圖3可以看出，三組間菌落可以分開一定距離，說明三組間菌落組成具有一定差異。

圖3 基于unweighted unifrac距離的主坐標(biāo)軸分析Fig.3 Primary coordinate axis analysis based on unweighted unifrac distance

2.4 討論

研究表明長期過量飲酒對腸道微生態(tài)具有不利影響[22]。人體攝入乙醇以后，在腸道中被腸道菌群代謝為乙醛。高濃度的乙醇和乙醛會損害腸道緊密連接，同時增加腸壁的通透性[23]。高濃度的乙醇會在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量內(nèi)毒素、引起腸道菌群的失調(diào)、造成肝臟損傷以及增加炎癥反應(yīng)[24]。本研究中，腸道菌群分析結(jié)果表明受試酒精濃度下的黃酒和酒精在一定程度上改變了受試小鼠的腸道細(xì)菌和種群結(jié)構(gòu)。投用黃酒和酒精顯著減少了Stenotrophomonas這種常見致病菌的比例[25]。黃酒組和酒精組的Ruminococcus的比例顯著高于對照組（P＜0.05），并且該菌屬在黃酒組中的相對豐度還高于酒精組。Ruminococcus在人體內(nèi)參與碳水化合物的水解，在結(jié)腸中發(fā)酵碳水化合物合成乙酸鹽供機(jī)體使用，是人腸道內(nèi)一種重要的益生菌[26]。黃酒組和酒精組Proteobacteria相對豐度顯著低于對照組，Proteobacteria包括許多致病菌，其含量可以作為厭氧菌紊亂的一個指示，并且變形菌門的豐度升高與菌群失調(diào)相關(guān)[27]。另外，與對照組和酒精組相比，黃酒組中厚壁菌門/擬桿菌門的比值（F/B）有升高的趨勢。F/B比值高的個體具有高的從食物中獲取能量的能力[28]。沈赤等[29]研究發(fā)現(xiàn)，紹興黃酒的多糖組分能促進(jìn)小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌的增殖并且抑制腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖，同時增加小鼠腸道內(nèi)的短鏈脂肪酸、乙酸、丁酸、乳酸含量的增加，發(fā)揮益生元作用。因此，推測黃酒對腸道菌群種群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用可能與其含有的多糖成分有關(guān)。另外，黃酒組的腸道菌群的豐富度指數(shù)下降，但群落多樣性指數(shù)并沒有明顯改變，表明本研究中所使用的黃酒濃度可能有一定的殺菌作用。王麗媛等[30]發(fā)現(xiàn)中劑量的黃酒可以提高高脂飲食小鼠的群落豐富度而對多樣性指數(shù)無影響，但低劑量和高劑量對腸道菌群的豐富度和多樣性均無影響。這些結(jié)果說明黃酒對腸道菌群多樣性的影響與黃酒的飲用量和飲食情況密切相關(guān)。

從上述腸道菌群分析結(jié)果可知，適量的酒精以及相同酒精濃度下的黃酒并未使小鼠腸道菌群的優(yōu)勢菌群含量發(fā)生巨大變化，但在一定程度上減少了Stenotrophomonas、Proteobacteria等潛在致病菌的含量。此外，黃酒與酒精的攝入對腸道菌群多樣性的影響略有不同，提示黃酒特有的物質(zhì)可能會對機(jī)體產(chǎn)生額外的影響，其效應(yīng)或許能在更高濃度的酒精攝入下進(jìn)行觀察。

3 結(jié)論

將24只4周齡雄性昆明種小鼠隨機(jī)等分為3組，分別灌胃生理鹽水、酒精、黃酒，連續(xù)灌胃30 d后，檢測血液生化指標(biāo)，二代測序檢測糞便細(xì)菌的種群構(gòu)成。結(jié)果表明，對照組小鼠血清中的ALT濃度顯著高于酒精組和黃酒組（P＜0.05）。黃酒組受試小鼠糞便細(xì)菌的三個α多樣性指數(shù)Ace、Chao1、PD_whole_tree均顯著低于對照組和酒精組（P＜0.05）。三個組腸道菌群組成具有一定差異。門水平上，對照組Proteobacteria相對豐度顯著高于酒精組和黃酒組（P＜0.05）；屬水平上，對照組Ruminococcus相對豐度顯著低于酒精組和黃酒組（P＜0.05），而Stenotrophomonas相對豐度顯著高于酒精組和黃酒組（P＜0.05），對照組Oscillospira相對豐度顯著低于酒精組（P＜0.05）。表明低濃度酒精和同樣酒精濃度下的黃酒并未對肝臟和腸道造成不利影響，并且都能在一定程度上抑制腸道致病菌的生長，增加部分有益菌的含量，從而對腸道菌群起到一定的調(diào)節(jié)作用。