文 雅，于雪榮，王泓午，郝 征，邢竹青

（天津中醫(yī)藥大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，天津 301617）

傳統(tǒng)的中藥提取主要是水煎或醇提法，但隨著現(xiàn)代發(fā)酵釀造工藝的不斷發(fā)展，利用微生物對中藥進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化成為一種新的趨勢。微生物在發(fā)酵中藥時(shí)，可以產(chǎn)生一些能夠分解轉(zhuǎn)化物質(zhì)能力的微生物，并能夠產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物，最終擴(kuò)大用藥范圍，增強(qiáng)藥物的療效[1]。

現(xiàn)代微生物學(xué)研究表明，大黃能增加腸蠕動(dòng)，保護(hù)腸道黏膜功能[2]；大黃有抗感染作用，對許多革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌，如脆弱類桿菌、單形類桿菌等均有一定的抑制作用[3]；大黃對流感病毒和假狂犬病毒的滅活作用也十分明顯，且對艾滋病病毒、霍亂毒素也有一定的抑制作用[4]；大黃有利膽和健胃作用；此外，還有調(diào)節(jié)免疫、清除氧自由基、致泄、保肝利膽、保護(hù)心腦血管、改善微循環(huán)、抗腫瘤等作用[4]。目前，已有很多報(bào)道表明，大黃可以有效抑制食源性致病菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌），并能應(yīng)用于食品保藏和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[5-7]。

本文將從大黃創(chuàng)新發(fā)酵技術(shù)優(yōu)勢、大黃發(fā)酵技術(shù)菌株種類和研究現(xiàn)狀、發(fā)酵技術(shù)目前的局限性幾個(gè)方面進(jìn)行闡述，為今后發(fā)酵大黃的規(guī)?；a(chǎn)提供指導(dǎo)和參考。

1 大黃傳統(tǒng)炮制的不足與大黃創(chuàng)新發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)勢

隨著中藥市場需求的增大，傳統(tǒng)炮制加工方法帶來的有效成分利用率低，藥效不穩(wěn)定，加工過程繁瑣等問題也日益凸顯。大黃的傳統(tǒng)炮制方法也正存在上述問題（見表1）。

表1 傳統(tǒng)大黃炮制的不良影響Table 1 Adverse effects of traditional rhubarb processing

大黃生用瀉下作用劇烈，易引起腹痛、惡心等胃腸道反應(yīng)。因此，在實(shí)際治療過程中，常經(jīng)不同的煎煮、加輔料炮制成各種炮制品，從而緩解大黃的瀉下作用及對胃腸道的不良反應(yīng)。然而，大黃煎煮過程愈長瀉下作用愈弱，煎煮大黃不僅引起結(jié)合蒽醌的水解，還會(huì)導(dǎo)致游離蒽醌的降解，甚至還存在蒽醌類成分間的化學(xué)轉(zhuǎn)化[8-9]。國外報(bào)道長期應(yīng)用大黃中蒽醌類成分可致肝、腎損害以及潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)[10-13]。這些問題都給大黃臨床應(yīng)用過程提出了很高的要求。所以，進(jìn)一步完善并創(chuàng)新大黃制劑的提取精制工藝，以減少蒽醌類成分的損失，對中藥大黃的高效利用及推廣有重要的現(xiàn)實(shí)意義[14]。

隨著現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)的飛速發(fā)展，利用微生物進(jìn)行發(fā)酵加工，較傳統(tǒng)炮制方法已有明顯優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在：（1）有利于實(shí)現(xiàn)中藥發(fā)酵技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化，專業(yè)化。在繼承傳統(tǒng)的中藥發(fā)酵技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用現(xiàn)代微生態(tài)學(xué)的成果知識(shí)，結(jié)合現(xiàn)代微生物工程形成的中藥制藥新技術(shù)，完成一些常規(guī)炮制方法難以實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)，較大幅度地改變藥性，提高療效，降低毒副作用[21]。（2）有利于在中藥創(chuàng)新研究領(lǐng)域開辟新的研究方向。近年來對于中藥藥用功能的研究越來越深入，但卻缺乏制藥過程的創(chuàng)新和進(jìn)步，此舉極大的阻礙了其實(shí)際臨床應(yīng)用中的穩(wěn)定性。通過采取更為經(jīng)濟(jì)、安全、無污染的中藥發(fā)酵技術(shù)對中藥進(jìn)行加工，開辟了其炮制過程的新角度和新思路。（3）有利于篩選具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生物轉(zhuǎn)化菌株。我國目前利用微生物發(fā)酵法進(jìn)行中藥生物轉(zhuǎn)化還處于剛剛起步的階段，發(fā)酵菌研究多集中于真菌[22]，大多使用常見的益生菌株進(jìn)行發(fā)酵。所以，為了取得更好的生物轉(zhuǎn)化效果，需要不斷搜集菌株的資源，為形成我國具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中藥生物轉(zhuǎn)化菌株庫奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[23]。

2 中藥大黃發(fā)酵技術(shù)國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

國內(nèi)應(yīng)用的發(fā)酵工藝主要采用固體發(fā)酵[24]。在適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集微生物自身的生長代謝和生命活動(dòng)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物。但利用中草藥發(fā)酵生產(chǎn)藥物的研究起步較晚，20世紀(jì)80年代的研究主要集中在真菌類自身發(fā)酵，多為單一發(fā)酵產(chǎn)生次生代謝，如靈芝菌絲體、冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵等[25]?，F(xiàn)代利用中草藥發(fā)酵的研究已從單味藥擴(kuò)展到復(fù)方研究且取得顯著成果，楊海龍等[26]借助真菌靈芝產(chǎn)生的豐富酶系通過對薏苡仁的轉(zhuǎn)化，使薏苡仁的主要成分發(fā)生了變化?！翱祻?fù)靈”為抗癌驗(yàn)方，主要成分有靈芝發(fā)酵菌、黨參、麥冬、豬苓、薏苡仁、淮山藥等，經(jīng)生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化后多數(shù)樣品具有抑制小鼠肉瘤生長的作用[27]。有研究使用酵母粉發(fā)酵大黃粗粉，發(fā)酵后，結(jié)合型蒽醌含量降低，游離型蒽醌含量增加6倍左右[15]。段維和[28]使用9株真菌對大黃進(jìn)行發(fā)酵改性研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)疣狀毛癬菌發(fā)酵后抗菌活性明顯增強(qiáng)，游離型蒽醌含量增加3倍左右。劉洋等[29]使用多種益生菌組合（干酪乳桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母）制成菌劑后，應(yīng)用于發(fā)酵復(fù)方中草藥（王不留行和益母草），發(fā)現(xiàn)可溶性總黃酮、總生物堿、粗多糖和總皂苷含量明顯提高。類似使用益生菌發(fā)酵大黃也有報(bào)道，明顯增強(qiáng)對于大腸桿菌的抑制作用[30]。

近年來，發(fā)酵藥材越來越受到研究者重視，在韓國和臺(tái)灣的學(xué)術(shù)界引起研究熱潮。有研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草菌發(fā)酵的五味子藥渣能夠提高仔豬的免疫功能[31-32]。陳茂彬[33]從根際土壤篩選到一株能轉(zhuǎn)化藜蒿黃酮類物質(zhì)的菌株，根據(jù)形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)特征可以初步鑒定為芽孢桿菌屬菌株，轉(zhuǎn)化后的總黃酮量是轉(zhuǎn)化前的7.56倍。國外對于中藥發(fā)酵的研究主要集中在酶和食品工程領(lǐng)域，在食品分析檢測過程中，以酶作為分析試劑，在基礎(chǔ)研究方法、檢驗(yàn)儀器和設(shè)備、酶試劑的來源和儲(chǔ)存、標(biāo)準(zhǔn)分析方法的制定以及應(yīng)用范圍上均領(lǐng)先于國內(nèi)[33]。如對肉桂的研究，肉桂的菌絲和子實(shí)體在預(yù)防和治療肝病方面具有潛在價(jià)值，有望被開發(fā)成保健食品或新藥。而發(fā)酵和栽培技術(shù)的應(yīng)用使這種藥用蘑菇的菌絲和子實(shí)體更容易獲得[34]。又如日本的納豆，用芽孢桿菌發(fā)酵大豆，利用芽孢桿菌中酶系豐富且能增加維生素K含量的特點(diǎn)，消除小腸內(nèi)致病菌，其提取物也具有明顯的抗癌活性和降壓作用[35]。也有用真菌曲霉接種到大黃中，然后測定發(fā)酵和未發(fā)酵的大黃提取物的化學(xué)成分以及抗氧化、抗菌、抗癌的活性的相關(guān)報(bào)道[36]。

目前，大黃發(fā)酵的研究還處于初級階段，已有的國內(nèi)相關(guān)研究報(bào)道較多，主要研究目標(biāo)集中在發(fā)酵菌株的篩選及蒽醌類型的轉(zhuǎn)化；國外研究相對較少，主要致力于有效物質(zhì)結(jié)構(gòu)和含量的轉(zhuǎn)化分析[37-38]。由于應(yīng)用現(xiàn)代科技技術(shù)對其展開科學(xué)研究時(shí)間較短，系統(tǒng)、成熟的利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)還鮮見報(bào)道。現(xiàn)有成果距離形成可供實(shí)際規(guī)?；a(chǎn)尚有較大差距，有必要借鑒上述成功的經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行進(jìn)一步深化的研究探討。

3 大黃發(fā)酵技術(shù)菌株種類

3.1 酵母菌作為發(fā)酵菌株

酵母菌作為發(fā)酵工業(yè)中的常用菌之一，在發(fā)酵大黃的研究中也被報(bào)道有很好的生物轉(zhuǎn)化效果。發(fā)酵后，使大黃中的結(jié)合型蒽醌有效地轉(zhuǎn)化為游離型蒽醌，從而降低大黃的峻瀉作用，進(jìn)而降低對胃腸道或其他的不良反應(yīng)。

高潔等[39]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，利用酵母菌發(fā)酵大黃，在一定條件下，游離型蒽醌的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到42.369%。戴萬生等[15]研究發(fā)現(xiàn)，大黃經(jīng)酒精酵母、面包酵母分別發(fā)酵后，總蒽醌含量略有降低，分別為生品的97.8%、98.2%，與有關(guān)文獻(xiàn)[40]比較，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的炮制方法均普遍使大黃總蒽醌含量明顯降低，說明發(fā)酵法有利于保存大黃總蒽醌，發(fā)酵法優(yōu)于傳統(tǒng)的炮制方法。同時(shí)，大黃經(jīng)酒精酵母、面包酵母分別發(fā)酵后，結(jié)合型蒽醌含量降低，分別為生品的52%、48%，而游離型蒽醌含量大大增加，分別為生品的594%、648%。說明發(fā)酵法也能使大黃結(jié)合型蒽醌有效的轉(zhuǎn)化為游離型蒽醌。馬超等[41]通過實(shí)驗(yàn)篩選到酵母菌株KM12，經(jīng)26S rRNA分子鑒定為馬克思科魯維酵母（Kluyveromyces marxianus），用菌株KM12發(fā)酵法炮制中藥大黃，能夠使結(jié)合型蒽醌分解或轉(zhuǎn)化成游離型蒽醌，從而緩和大黃的峻烈瀉下作用。

3.2 霉菌和蕈菌作為發(fā)酵菌株

呂平[42]優(yōu)化了菌株素赭曲霉（Aspergillus ochraceus）LP-0301，通過鈉離子注入獲得大黃素高產(chǎn)菌株，并且優(yōu)化了發(fā)酵條件，使其最終產(chǎn)率達(dá)1.453 mg/L，比出發(fā)菌株提高2.96倍。因此由菌株LP-0301發(fā)酵產(chǎn)大黃素的含量較藥用植物高，有很好的開發(fā)價(jià)值。

鄔吉野[43]通過建立槐耳大黃雙向發(fā)酵體系，明顯提高了大黃的轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果顯示，經(jīng)槐耳雙向發(fā)酵后，結(jié)合型蒽醌含量降低明顯，游離型蒽醌含量增加明顯，說明發(fā)酵法能使大黃結(jié)合型蒽醌轉(zhuǎn)化為游離型蒽醌，從而緩和大黃峻瀉作用，且雙向發(fā)酵后槐耳大黃菌質(zhì)體系有新成分產(chǎn)生，并有一定的抑制腫瘤效果。

3.3 益生菌作為發(fā)酵菌株

由于益生菌在腸道功能改善研究中的突出表現(xiàn)，也有學(xué)者探討了利用不同益生菌發(fā)酵大黃后的產(chǎn)物變化。韓佳慧等[30]通過利用益生菌N-14對大黃進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵大黃與水煎液大黃相比，對大腸桿菌的抑制作用大大增強(qiáng)。王惠蕓等[44]在雙歧桿菌對12種中藥的發(fā)酵與抗菌活性檢測分析中發(fā)現(xiàn)：12種中藥通過雙歧桿菌的發(fā)酵作用，使得抗菌活性發(fā)生不同程度的變化。但大黃發(fā)酵前以及發(fā)酵之后對于細(xì)菌的抑制作用并沒有非常明顯的變化。

3.4 內(nèi)源菌群發(fā)酵

利用內(nèi)源菌群相對來說簡單易得，因此很多學(xué)者也對此進(jìn)行了摸索。王楠[45]利用植物大黃地上葉片部分中存在的一種內(nèi)生真菌-葉點(diǎn)霉菌為發(fā)酵菌株，R7269大黃酸為標(biāo)準(zhǔn)品，對實(shí)驗(yàn)條件多次優(yōu)化后，測得葉點(diǎn)霉發(fā)酵液中總蒽醌類物質(zhì)的平均得率可達(dá)23.96 mg/g。于志偉等[46]以一株分離自高原掌葉大黃的腐皮鐮刀菌R13為研究對象，通過調(diào)節(jié)初始pH以及添加丙酸和丙二酸，可以促進(jìn)該菌生產(chǎn)大黃素，最終大黃素產(chǎn)量可達(dá)3.908 mg/L，有望成為大黃素高產(chǎn)菌株。

3.5 外源菌株發(fā)酵

目前，用于大黃發(fā)酵的菌株也有來自其他植物或動(dòng)物資源，經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化后的活性物質(zhì)可用于抗氧化或改變腸道菌群結(jié)構(gòu)。

楊玉紅等[47]以自主篩選的軟棗獼猴桃內(nèi)生真菌Z2為發(fā)酵菌株，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)酵后的大黃可生產(chǎn)具有多功能抗氧化活性的蒽醌，蒽醌類物質(zhì)質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力為72.27%，對超氧陰離子的清除能力為13.33%，對烷基自由基的清除能力高達(dá)76.75%。王瑞風(fēng)等[48]研究認(rèn)為，大黃酸經(jīng)小鼠本身的菌群作用后，可增加糖尿病小鼠腸道中的擬桿菌，同時(shí)減少硬壁菌，使擬桿菌與硬壁菌的比例升高，而已有研究表明，擬桿菌比例的下降可以導(dǎo)致代謝紊亂[49]。

4 大黃發(fā)酵技術(shù)的局限性

就大黃本身來說，我國尚缺乏生物轉(zhuǎn)化大黃的深入研究。雖然目前已有多種微生物種類應(yīng)用于大黃的發(fā)酵條件摸索，但存在實(shí)際應(yīng)用生產(chǎn)轉(zhuǎn)化率不高的現(xiàn)實(shí)問題。發(fā)酵后的大黃所含成分及藥理作用的影響，也有待進(jìn)一步研究發(fā)展。雖然我國的發(fā)酵技術(shù)歷史悠久，但中藥菌株發(fā)酵技術(shù)仍處于起步階段，存在諸多亟待解決的問題，例如：單一菌種與混合菌種之間的選擇，單味中藥與復(fù)方中藥之間的權(quán)衡，體內(nèi)發(fā)酵與體外發(fā)酵的比較，生物制品和創(chuàng)新藥物的定位問題等[50]。對中草藥的成分進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，進(jìn)而確定轉(zhuǎn)化前后藥效的變化，需要微生物學(xué)、中醫(yī)學(xué)、中藥學(xué)、分析化學(xué)、藥理學(xué)等多學(xué)科參與。同樣，存在于發(fā)酵大黃開發(fā)中也有一系列的疑問需要解開：微生物發(fā)酵體系構(gòu)成如何、發(fā)酵時(shí)是否改變了大黃的藥效成分，微生物代謝是否產(chǎn)生了新的成分，發(fā)酵后的大黃產(chǎn)物對于腸道疾病的作用效果如何？存在何種作用機(jī)制？這些無疑是一個(gè)個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

5 展望

利用微生物進(jìn)行食品行業(yè)中的釀造和品質(zhì)改良的傳統(tǒng)由來已久，也已取得非常突出成果，但是利用發(fā)酵技術(shù)轉(zhuǎn)化中藥成分還處于初級階段，擁有巨大的發(fā)展?jié)摿?。發(fā)酵工程和酶工程已被列為中醫(yī)藥領(lǐng)域創(chuàng)新轉(zhuǎn)化的重要項(xiàng)目之一，其中發(fā)展傳統(tǒng)中醫(yī)藥，是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化、具有高科技水平的新技術(shù)[30]。有學(xué)者呼吁將單味中藥、具有類似或協(xié)同作用的中藥進(jìn)行發(fā)酵，以達(dá)到產(chǎn)生新化合物、增強(qiáng)功效或者降低單一藥物不良作用的效果。中藥經(jīng)發(fā)酵、生物轉(zhuǎn)化后，其有效成分能被充分分離、提?。唤?jīng)生物轉(zhuǎn)化更具有生物活性，在中藥現(xiàn)代化過程中具有重要地位。由此，在大黃的有效成分轉(zhuǎn)化過程中，借助中藥發(fā)酵技術(shù)，研究大黃發(fā)酵現(xiàn)狀的意義得以凸顯。應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)大規(guī)模工業(yè)化提取中草藥的有效生物活性成分，發(fā)展具有中國特色的生物技術(shù)醫(yī)藥工業(yè)具有廣闊的前景。