張志強，張艷英，葛 成，王 苗，杜萬年，莘 余，吳同壘，索 勛，李蘊玉*，李佩國*

（1. 河北科技師范學院 河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，河北 秦皇島 066004；2. 中國農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，北京 100094）

O 抗原位于革蘭氏陰性菌的最外表面，是具有保護性作用的一種細菌結(jié)構。該結(jié)構由短的重復的寡糖單元（O 單元）組成，每個寡糖單位含有3～8 個不等的單糖分子[1]。寡糖單位組成和分布的多樣性造成了不同種屬甚至同一細菌的抗原性差異，同時也是內(nèi)毒素LPS 的組成成分，其在細菌致病過程中發(fā)揮關鍵作用[2-3]。革蘭氏陰性菌O抗原的合成是一個復雜的過程，涉及Wzx/Wzy 途徑40 多種酶的參與[4]。細菌首先于細胞內(nèi)膜表面合成寡糖單位，利用wzx編碼的外翻酶將寡糖單元轉(zhuǎn)移至周質(zhì)間隙，在wzy編碼聚合酶作用下進行O 抗原側(cè)鏈的合成，側(cè)鏈的組成和長度由wzz 編碼蛋白調(diào)控；合成的O 抗原在waaL 基因編碼的連接酶的作用下結(jié)合到脂多糖（LPS）脂質(zhì)A 核心上，通過Lpt 途徑轉(zhuǎn)運到細胞外膜表面[5-6]。

Wzx 翻轉(zhuǎn)酶介導O 抗原合成原料的轉(zhuǎn)運，是O抗原合成的起始和關鍵環(huán)節(jié)，前期有研究將Wzx 基因簇缺失，會導致細菌O抗原產(chǎn)量下降以及細菌生長速度的減緩，揭示了其在細菌生長中的重要作用[1]。Wzx 基因簇由多個基因組成[7]，不同的基因發(fā)揮何種作用尚不明確。本研究聚焦該基因簇的wzxE 基因，擬通過同源重組方法構建其缺失菌株，通過分析wzxE 基因缺失菌株的生物學特性變化，揭示W(wǎng)zxE翻轉(zhuǎn)酶的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及主要試劑λ-Red 同源重組系統(tǒng)（包括pKD46、pKD3 和pCP20 質(zhì)粒）由揚州大學朱國強教授惠贈；雞白痢沙門菌參考菌株ATCC19945 由吉林省出入境檢驗檢疫局王偉利研究員惠贈。1 日齡白來航雛雞，由河北科技師范學院實驗牧場提供。

細菌基因組提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；LATaq DNA 聚合酶預混液（2×）、限制性內(nèi)切酶及T4 連接酶均購自TaKaRa 公司；細菌脂多糖（LPS）提取試劑盒購自貝博生物技術有限公司；銀染試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；SDS-PAGE 凝膠試劑盒和ECL 化學發(fā)光液購自康維世紀生物技術有限公司。

1.2 λ-Red 同源重組引物的設計根據(jù)NCBI 登錄的白痢沙門菌基因組序列（CP012347.1）設計引物（表1），P1/P2 用于擴增含有氯霉素基因的打靶片段；P3/P4 為RT-qPCR 引物，用于缺失株的轉(zhuǎn)錄水平鑒定。P5/P6 用于缺失株的PCR 鑒定；P7/P8 用于構建回補菌株，P9/P10 為RT-qPCR 沙門菌內(nèi)參基因GMK 引物。

表1 本研究用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.3 沙門菌wzxE基因缺失株及回補菌株的構建參照文獻[8]，利用同源重組方法從白痢沙門菌ATCC19945 基因組中敲除目的基因wzxE，得到基因缺 失 菌 株ATCC19945ΔwzxE。利 用PCR（P5/P6）和RT-qPCR（P3/P4）方法鑒定基因缺失菌株，并對其進一步測序鑒定。

以提取ATCC19945 基因組為模板，利用P7/P8引物擴增wzxE 基因，將其克隆至pBR322 質(zhì)粒。將構建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至基因缺失菌株中，構建回補菌株pBR322-wzxE/ATCC19945ΔwzxE。文中分別用縮寫字母WT（Wild type）、KO（Knock-out）和RS（Recomplemented strain）代表本文涉及的野生型菌株、wzxE 基因缺失株以及回補菌株。

1.4 沙門菌生長特性檢測分別將白痢沙門菌3 個菌株接種液體LB，37 ℃過夜培養(yǎng)后以1∶50 比例轉(zhuǎn)接新鮮LB 或M9 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)；每隔2 h 吸取菌液樣品，測定其OD600nm值，繪制3 種菌的生長曲線。

1.5 沙門菌對環(huán)境應激抵抗力的測定利用鹽酸調(diào)整生理鹽水至pH 3.5，同時向生理鹽水中添加H2O2至終濃度為10 mmol/L。參照文獻[9]，分別檢測白痢沙門菌3 個菌株在酸性應激條件（pH 3.5 生理鹽水處理1 h）和氧化應激條件（10 mmoL/L H2O2處理20 min）下的存活情況。對應激條件下的細菌培養(yǎng)物進行計數(shù)，計算3 種菌的存活率（存活菌數(shù)/處理前菌數(shù)×100%）。試驗重復3 次，實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用prism 5.0 軟件分析。

1.6 wzxE 對白痢沙門菌蛋清存活能力的影響參照文獻[10]，將白痢沙門菌3 個菌株培養(yǎng)物分別稀釋至2×103cfu/mL～4×103cfu/mL 后分別加入1.5 mL 蛋清液中充分混勻，于不同時間對各培養(yǎng)物進行計數(shù)，計算其存活率。

1.7 細菌對1 日齡雛雞致病力的檢測參照文獻[11]，利用1 日齡雛雞模型評價白痢沙門菌WT、RS和KO 株致病力。將160 只雛雞隨機分為4 組，包括3個實驗組和1個對照組，實驗組每組50只，分別以1×105cfu、1×106cfu、1×107cfu、1×108cfu、1×109cfu 的劑量肌肉注射白痢沙門菌3 個菌株，每一劑量10只；對照組10 只，接種等體積PBS。連續(xù)觀察2 周并統(tǒng)計死亡情況，根據(jù)改良寇氏法計算各菌株對雛雞的LD50。

1.8 wzxE 對白痢沙門菌LPS 的表達影響參照文獻[12]，利用細菌LPS 提取試劑盒提取白痢沙門菌WT 和KO 株的脂多糖成分。將提取的各菌株脂多糖在15%的凝膠內(nèi)進行SDS-PAGE 凝膠電泳，凝膠充分洗滌后，利用銀染試劑盒染色，檢測wzxE 對白痢沙門菌LPS 的影響。同時設置考馬斯亮藍染色對照，排除蛋白污染情況。

2 結(jié) 果

2.1 雞白痢沙門菌KO 株的構建利用鑒定引物P5/P6 對雞白痢沙門菌野生型菌株、一次重組菌株、二次重組菌株進行PCR 鑒定。結(jié)果顯示，野生型菌株擴增片段大小約為1 800 bp（ATCC 19945），一次重組菌株擴增片段約為1 600 bp（ATCC 19945::cat），二次重組菌株擴增片段約為600 bp（ATCC 19945ΔwzxE），均與預期相符（圖1）；對二次重組菌株PCR 鑒定產(chǎn)物進行測序，以及利用P3/P4 引物qRT-PCR 方法進一步驗證了wzxE 基因缺失株ATCC 19945ΔwzxE 正確構建。

圖1 雞白痢沙門菌KO 株的PCR 鑒定Fig.1 Identification of the wzxE gene deletion in Salmonella Pullorum by PCR

2.2wzxE基因缺失對雞白痢沙門菌生長特性的影響將雞白痢沙門菌3 個菌株分別接種LB 培養(yǎng)基和M9 培養(yǎng)基，測定其不同時間點OD600nm值，繪制其生長曲線。結(jié)果顯示，無論是在普通LB 培養(yǎng)基中還是營養(yǎng)相對缺乏的限制性培養(yǎng)基M9 中，3 株細菌的生長速度均未呈現(xiàn)明顯差異（圖2）。表明，wzxE 基因缺失不影響雞白痢沙門菌的生長。

圖2 雞白痢沙門菌ATCC19945 相關菌株生長曲線測定Fig.2 Growth characteristics of ATCC 19945 related strains

2.3wzxE基因缺失對白痢沙門菌應對酸性和氧化應激的影響分別測定雞白痢沙門菌各菌株在酸性和氧化應激條件下的存活情況。結(jié)果顯示，在pH 3.5的生理鹽水作用下，KO株的存活情況明顯低于WT 和RS，同時RS 較WT 回復明顯（圖3A）；同樣的，KO 株耐受H2O2的能力也顯著低于WT 株和RS 株（圖3B），回補之后得到明顯回復。上述結(jié)果表明，wzxE缺失影響雞白痢沙門菌在酸性和氧化應激條件下的生存。

圖3 環(huán)境應激對wzxE 基因缺失株生長的影響Fig.3 Effects of environmental stress on the growth of wzxE gene deficient strains

2.4 wzxE 對雞白痢沙門菌蛋清中存活能力的檢測結(jié)果分別測定雞白痢沙門菌各菌株在蛋清內(nèi)的存活率。結(jié)果顯示，雞白痢沙門菌WT 株能夠抵御蛋清的殺傷作用，隨著孵育時間延長，菌量稍有下降；而wzxE基因缺失后，白痢沙門菌在蛋清內(nèi)的存活能力下降明顯，在第6 h和第9 h，存活率僅為17%和13%；回補株應對蛋清殺傷的能力得到部分恢復（圖4）。上述結(jié)果表明wzxE基因影響白痢沙門菌在蛋清的存活。

圖4 wzxE 基因缺失對ATCC19945 菌株在蛋清中存活率的影響Fig.4 Viability of wzxE gene deficient strains in egg white

2.5wzxE基因缺失對白痢沙門菌毒力影響分別將雞白痢沙門菌各菌株感染1 日齡雛雞，計算其對雛雞的LD50。結(jié)果顯示，雞白痢沙門菌WT、KO 和RS 株LD50分別為1.65×108cfu、4.67×108cfu和3.43×108cfu，變化不大。表明wzxE 基因缺失對白痢沙門菌毒力影響較小。

2.6 wzxE 對白痢沙門菌LPS 表達的影響提取白痢沙門菌各菌株LPS，利用銀染方法觀察2 株菌LPS條帶。結(jié)果顯示，考馬斯亮藍染色未在LPS 樣品中檢出條帶，表明提取的LPS 無蛋白污染；銀染結(jié)果顯示，2 株細菌LPS 電泳條帶的帶型類似，但缺失株LPS 條帶與野生型和回補株相比條帶濃度減?。▓D5）。表明wzxE 不影響白痢沙門菌LPS 總體成分構成，但影響特定LPS 特定寡糖單位的含量。

圖5 白痢沙門菌LPS 提取及染色分析Fig.5 Extraction and staining analysis of LPS of ATCC19945 related strains

3 討 論

Wzx 基因簇是細菌內(nèi)介導寡糖單位向周質(zhì)間隙轉(zhuǎn)運的一類基因的總成，其編碼蛋白具有多樣性，有研究證實這種多樣性是造成細菌O 抗原多樣性的重要原因[13-14]。針對wzx 基因簇的研究已有部分報道，其功能不斷被解析，但具體到該簇基因的每個基因功能還有待挖掘。本研究即利用基因缺失和生物學特性分析方法針對該簇的wzxE 基因功能進行挖掘。

前期有研究表明wzx 基因簇不僅能夠影響細菌O 抗原的產(chǎn)量，還會影響細菌的生長[1]，其機制尚不明確。因此本研究首先檢測了wzxE 基因缺失對白痢沙門菌生長的影響，結(jié)果顯示wzxE 缺失并未影響細菌的生長，說明影響細菌生長的是wzx 基因簇中的其它基因。

O 抗原作為細菌外膜的構成成分，同時具有保護作用[15]。為此，本研究也檢測了wzxE 缺失后的白痢沙門菌自我保護能力是否發(fā)生變化。本實驗分析了白痢沙門菌在感染過程中可能遇到的最大的兩種應激：酸性應激和氧化應激，這兩種應激是白痢沙門菌經(jīng)過消化道感染以及胞內(nèi)寄生所無法避免的挑戰(zhàn)[16]。結(jié)果顯示，wzxE 基因缺失后白痢沙門菌應對酸性應激和氧化應激的能力顯著下降。雞白痢能夠得以廣泛傳播，并且難于防控的一大誘因在于其能夠經(jīng)卵垂直傳播。雞蛋的蛋清內(nèi)含有大量的殺菌物質(zhì)，如溶菌酶類和轉(zhuǎn)鐵蛋白，能夠有效的實施對卵內(nèi)微生物的有效殺傷[8]。在長期的進化中，雞白痢沙門菌能夠使這些殺菌物質(zhì)的殺傷作用得以存活，O 抗原在其中發(fā)揮了一定作用。前期有研究發(fā)現(xiàn)將O 抗原合成重要基因waaL 缺失會導致沙門菌在蛋清內(nèi)的存活能力顯著下降[15]，那么wzxE 缺失是否會影響白痢沙門菌的蛋內(nèi)存活呢？本研究結(jié)果顯示，wzxE 基因缺失后，白痢沙門菌在蛋清內(nèi)的存活能力顯著下降。

LPS 是革蘭氏陰性菌的重要毒力因子，由脂質(zhì)A、胞外多糖以及O 抗原組成[2]。有研究表明作為O抗原合成的主要途徑，wzx、wzy、waaL 等任一基因簇缺失都會嚴重影響細菌LPS 的生成[14]。但是O 抗原的合成途徑十分復雜，涉及到40 余種酶的參與，具體到每一種酶對細菌LPS 合成的影響有較大差異，如wzxB[14]、wzyB[14]、waaL[15]、wbaV[17]基因的缺失均會引起細菌LPS 的顯著變化，而wzzE 則并不影響細菌LPS 的合成[18]。本研究同樣檢測了wzxE 對白痢沙門菌LPS 的影響，銀染結(jié)果顯示，wzxE 不影響白痢沙門菌LPS 的總體構成，但影響不同寡糖單位的豐度。這與前人研究證實wzxE 并不是轉(zhuǎn)運所有的寡糖單位，而是有針對性的轉(zhuǎn)運不含側(cè)鏈的寡聚3,6-二脫氧甘露糖[14]的結(jié)論一致。LPS 影響革蘭氏陰性細菌的致病力，前期已有多種研究表明O 抗原合成涉及的部分酶與細菌毒力相關，如waaL、wzzE 基因缺失后細菌毒力下降明顯[15,18]。Wzx 基因簇與細菌毒力的密切關系已被證實[1]，但其中每個基因與細菌的毒力關系如何，尚不明確，本研究評估了wzxE 基因缺失菌株的毒力情況，結(jié)果顯示，wzxE 基因缺失后，白痢沙門菌對雛雞的LD50僅下降約3 倍，表明該基因?qū)﹄u白痢沙門菌致病性影響不大。

本研究構建了雞白痢沙門菌wzxE 基因缺失菌株并對其部分生物學特性進行分析，確認了wzxE 與細菌抗應激、蛋清存活、LPS 合成以及細菌致病力間的密切關系，為白痢沙門菌致病機制研究以及防控提供了參考。