仲 艷，王希玉，李海賓，馮 政，胡建樂，費中杰，楊 銅，錢 程，張凱云，劉岳龍，秦 濤，陳素娟*，彭大新*

（1. 揚州大學 獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225000；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；3. 江蘇立華牧業(yè)股份有限公司，江蘇 常州 213100）

沙門菌（Salmonella）是一種非常重要的人獸共患病原菌，血清型眾多，目前已報道的血清型約有2600 種，中國至少有292 種。禽類感染沙門菌主要引起雞白痢、禽傷寒和副傷寒，主要侵害幼齡和青年動物，多表現(xiàn)為腸炎和敗血癥；禽沙門菌病不僅可以水平傳播，還能垂直傳播[1]，可導致禽群生產性能降低，影響雛禽的存活率，給養(yǎng)禽業(yè)帶來重大損失。目前，沙門菌被認為是世界范圍內重要的食源性致病菌[2]，食物傳播是人類感染沙門菌的主要途徑，畜禽及其肉制品和蛋是沙門菌等食源性病原菌的重要傳播基質[3]。我國對禽沙門菌病非常重視，將其列為16 種優(yōu)先防治的動物疫病之一[4]。因此，禽沙門菌病的防治已成為養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的重要問題之一。

目前在家禽養(yǎng)殖生產中，抗生素的濫用導致細菌耐藥現(xiàn)象嚴重[5]，許多病原菌在選擇壓力下出現(xiàn)了多重耐藥[6]，結合近幾年華東地區(qū)禽沙門菌分離株的耐藥研究來看[7-8]，耐藥抗生素種類在逐年增加，這不僅給養(yǎng)殖業(yè)沙門菌病的防控帶來困難，終究會對人類健康造成威脅。因此，本研究對2016 年～2018 年華東地區(qū)不同地方的家禽沙門菌進行了持續(xù)的流行病學調查及耐藥性研究，并做了統(tǒng)計學分析，為預防和控制沙門菌病的流行及傳播提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源2016 年～2018 年于揚州大學動物醫(yī)院畜禽門診及養(yǎng)殖場送檢樣本中采集患病雞、鴨、鵝和鴿的疑似沙門菌感染的肝臟樣品各195份、67 份、138 份和37 份，主要來于華東地區(qū)的揚州、南京、鎮(zhèn)江、淮安、滁州、天長及六安等地的養(yǎng)禽場。

1.2 主要試劑普通LB 培養(yǎng)基所需蛋白胨和酵母提取物為英國OXOID 公司產品；純化瓊脂粉購自國藥集團；沙門菌顯色培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技公司；2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）購自南京諾唯贊公司；瓊脂糖購自Biowest 公司；21 種藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；沙門菌屬診斷血清購自寧波天潤藥業(yè)有限公司。

1.3 革蘭氏染色鏡檢以常規(guī)無菌操作方法，用無菌接種環(huán)蘸取少量組織，劃線接種于顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取疑似菌落純化培養(yǎng)后挑取少許沙門菌菌液于載玻片，革蘭氏染色后鏡檢，觀察細菌染色情況與形態(tài)。

1.4 沙門菌的多重PCR（mPCR）檢測采用楊林等建立的mPCR 方法[9]，以煮沸裂解法制備可疑細菌的DNA 模板，采用沙門菌屬特異性基因hut 及型特異性基因SdfI、Spy、glgc 和Spec 引物進行PCR 擴增，鑒定沙門菌類型。對檢測結果為沙門菌分離株的宿主來源、年份和季節(jié)因素進行分析。

1.5 分離菌玻板凝集試驗對于未知血清型的沙門菌，采用玻板凝集試驗鑒定：首先用沙門菌A-F群O 抗原多價血清和H 抗原多價血清進行血清凝集試驗，再用O 抗原單因子血清和H 抗原單因子血清進一步鑒定，同時用生理鹽水作對照。按照Kauffman-White 分類體系進行血清學分型。

1.6 藥敏試驗采用紙片瓊脂擴散法進行藥敏試驗。挑取單個菌落，在LB 固體培養(yǎng)基上均勻劃線涂布于整個培養(yǎng)基表面。取藥敏紙片貼到LB 固體培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)16 h～18 h 后量取抑菌圈直徑，重復3 次，取平均值。參考杭州天和微生物試劑有限公司《藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標準》判斷該菌對不同藥物的敏感性。

2 結 果

2.1 分離菌的形態(tài)學鑒定經純化培養(yǎng)后觀察可見，在顯色培養(yǎng)基上分離菌呈紫紅色或紫羅蘭色、扁平透明的菌落。革蘭氏染色結果呈紅色、兩端鈍圓的短桿菌，為革蘭氏陰性菌（圖1）。

圖1 沙門菌的革蘭氏染色試驗結果Fig.1 Gram staining of Salmonella

2.2 沙門菌的mPCR鑒定經mPCR鑒定，可疑菌株中有233株可擴增出495 bp的屬特異性條帶（圖2），表明均為沙門菌。

圖2 沙門菌分離株的mPCR 鑒定結果Fig.2 Identification of Salmonella isolates by mPCR

2.3 沙門菌的血清分型及沙門菌分離株的宿主來源和季節(jié)分布結合mPCR 試驗與血清凝集試驗鑒定分離株血清型，血清型鑒定結果表明，110 株可同時擴增出401 bp 的型特異性條帶，為鼠傷寒沙門菌（47.21%）；82 株可同時擴增出252 bp 的型特異性條帶，為雞白痢沙門菌（35.19%）；25 株可同時擴增出304 bp 的型特異性條帶，為腸炎沙門菌（10.73%）（圖2）。剩余的16 株經玻板凝集試驗鑒定分別為5株德爾卑沙門菌（2.14%）、3 株紐波特沙門菌（1.29%）、2株波斯坦沙門菌（0.86%）、2株都柏林沙門菌（0.86%）、2 株豬霍亂沙門菌孔成道夫生物型（0.86%）、1 株邦戈爾沙門菌（0.43%）和1 株斯坦利沙門菌（0.43%）（表1）。以上結果表明，華東地區(qū)禽沙門菌的優(yōu)勢血清型是鼠傷寒沙門菌和雞白痢沙門菌。

來源分布顯示雞源分離株以雞白痢沙門菌為主，鴨源、鵝源和鴿源分離株均以鼠傷寒沙門菌為主（表2）。季度分布統(tǒng)計結果顯示，每年第二季度和第三季度沙門菌的分離率較高，第一季度和第四季度的分離率相對較低（圖3）。

表2 沙門菌分離株宿主來源統(tǒng)計結果Table 2 Host sources of Salmonella isolates

圖3 沙門菌分離株季節(jié)分布統(tǒng)計結果Fig.3 Quarterly distribution of Salmonella isolates

2.4 藥敏試驗結果及分析

2.4.1 藥敏試驗結果藥敏試驗結果顯示，近3年沙門菌臨床分離株普遍對青霉素、苯唑西林、利福平和紅霉素耐藥，尤其對青霉素、苯唑西林、利福平和紅霉素的耐藥菌株占比均達到了85%以上，最高至100%。2018年的沙門菌分離株對頭孢西丁、四環(huán)素和復方新諾明的耐藥性有明顯的提高，耐藥菌株分別由0、6.41%和61.54%上升至57.5%、93.7%和87.5%。敏感性抗生素主要有慶大霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考和氯霉素，敏感菌株占比均在80%左右（表3）。結果表明，抗生素的大量使用會使沙門菌的耐藥特性發(fā)生改變。

表3 沙門菌分離株對抗生素的藥敏試驗結果Table 3 Resistance rates of Salmonella isolates to antibiotics

2.4.2 沙門菌分離株的多重耐藥統(tǒng)計結果233 株禽源沙門菌分離株中，213 株對3 類及3 類以上抗生素（β-內酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、利福霉素類、大環(huán)內酯類、四環(huán)素類、酰胺醇類、磺胺類）耐藥，多重耐藥菌株占比達91.42%。其中2016年、2017 年和2018 年分離株的多重耐藥菌株占比分別為91.03%、92.96%和90.48%（圖4），主要耐藥譜為苯唑西林-青霉素-利福平-紅霉素。表明沙門菌的多重耐藥現(xiàn)象較為嚴重。

圖4 233 株家禽沙門菌分離株對21 種抗菌藥物的多重耐藥譜Fig.4 Multi-drug profiles of 233 Salmonella isolates from poultry to 21 antimicrobial agents

3 討 論

沙門菌在自然界中十分普遍，對家禽健康和人類公共安全均具有嚴重的影響，是重要的人獸共患病原菌[10-11]。焦庫華等報道2005 年～2008 年在鹽城、南通、連云港、淮安等地的分離結果顯示，雞白痢沙門菌為優(yōu)勢血清型[12]；查華等報道2010 年～2012年在江蘇、安徽、上海等地的分離結果顯示，禽源沙門菌中雞白痢沙門菌為優(yōu)勢血清型[13]；張林吉等報道2014 年～2015 年在江蘇徐州地區(qū)禽源沙門菌的臨床檢測結果顯示，鼠傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清型[14]；沈學懷等報道在2015 年～2016 年安徽地區(qū)的沙門菌分離情況顯示，雞傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清型[8]；段瑤等報道在2006 年～2016 年我國各地畜禽來源的沙門菌血清型鑒定結果表明，腸炎沙門菌為優(yōu)勢血清型[15]。本究結果表明，2016 年～2018 年從患病家禽中共分離到233 株沙門菌，鼠傷寒和雞白痢為優(yōu)勢血清型，鴨源、鵝源和鴿源分離株以鼠傷寒沙門菌為主，雞源分離株以雞白痢沙門菌為主，表明不同宿主、不同地區(qū)或不同養(yǎng)殖方式可能存在不同血清型沙門菌的流行，華東地區(qū)家禽源沙門菌優(yōu)勢血清型已發(fā)生了變化。

比較2016 年～2018 年的沙門菌分離株血清型種類可以發(fā)現(xiàn)，2016 年僅分離到鼠傷寒、雞白痢和腸炎3 種血清型；2017 年除了分離到鼠傷寒、雞白痢和腸炎血清型外，還有紐波特和邦戈爾血清型；而2018 年共分離到鼠傷寒、雞白痢、腸炎、德爾卑、紐波特、波斯坦、斯坦利、都柏林和豬霍亂沙門菌孔成道夫生物型?？赡艿脑蚴遣煌貐^(qū)禽類養(yǎng)殖場之間引種和交易的頻繁，或是由于不同禽類來源的復雜化，引起不同血清型沙門菌的傳播，導致越來越多的血清型在華東地區(qū)出現(xiàn)，這給沙門菌病的防治帶來更大的困難。

對不同季度的沙門菌分離率比較發(fā)現(xiàn)，不同季度的沙門菌分離率具有一定的差異，其中第二季度和第三季度分離率相對較高，第四季度次之，第一季度最低。季度差異的出現(xiàn)，除了氣溫的巨大差異會導致細菌增殖和傳播的差異，可能與養(yǎng)殖場在不同季度的飼養(yǎng)管理情況如消毒劑的使用和用藥情況也有關系。

臨床上抗生素的使用對抑制細菌性疾病的傳播與感染發(fā)揮了巨大的作用，而藥物的長期反復以及不合理使用，使沙門菌的耐藥性逐漸增強，耐藥譜也逐漸增寬。張博在2018 年的研究表明，遼寧省東部地區(qū)禽源沙門菌對四環(huán)素的耐藥率也已高達88.24%[16]；岳 秀 英 等 在2009 年～2014 年 對 雞 源 沙 門菌耐藥性變遷的調查研究結果表明，復方新諾明、慶大霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素等耐藥率隨年份的推移呈上升趨勢[17]。本研究結果表明，近3 年華東地區(qū)沙門菌分離株的多重耐藥率一直維持在很高水平，均在90%以上。對頭孢西丁、四環(huán)素和復方新諾明的耐藥率有顯著的上升。因此，必須加強抗菌藥物的合理使用，遏制沙門菌耐藥的不斷發(fā)展。

鼠傷寒沙門菌和雞白痢沙門菌是華東地區(qū)家禽中優(yōu)勢流行株，分離菌株的多重耐藥率高達91.42%，且對一些抗生素耐藥率顯著上升。本研究結果為華東地區(qū)家禽沙門菌的防治提供了科學依據。