張 鵬 楊 琳 趙 蕾 吳冰冰 李西華 程國強(qiáng)

神經(jīng)肌肉疾病(NMDs)是一組嚴(yán)重致畸、致殘的異質(zhì)性疾病，包括脊髓前角運(yùn)動細(xì)胞病變、遺傳代謝性疾病、神經(jīng)肌肉接頭疾病和各種神經(jīng)源性骨骼肌損傷等，累及外周神經(jīng)、神經(jīng)肌肉接頭及骨骼肌，常表現(xiàn)為肌張力低下和肌無力。常見的癥狀和體征包括呼吸衰竭、骨骼畸形、關(guān)節(jié)攣縮、步態(tài)異常，伴或不伴感覺異常和心臟受累等。新生兒期往往表現(xiàn)為四肢松軟、呼吸乏力、關(guān)節(jié)攣縮和吞咽困難等[1, 2]。大部分NMDs的臨床表現(xiàn)非常相似或者不典型，給臨床診斷帶來困難。詳細(xì)的病史詢問、神經(jīng)系統(tǒng)體格檢查、實(shí)驗(yàn)室及診斷性檢查有助于疾病的定位。肌肉病理活檢(MB)可從蛋白質(zhì)和病理結(jié)構(gòu)水平認(rèn)識NMDs的發(fā)生及發(fā)展，二代基因測序(NGS)技術(shù)有助于鑒別特異性的遺傳缺陷。目前國內(nèi)有關(guān)新生兒期NMDs的報道多為個案[3-6]。本文回顧性分析復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)新生兒科收治的連續(xù)的確診NMDs病例的臨床資料，旨在加強(qiáng)對新生兒期NMDs的臨床認(rèn)識。

1 方法

1.1 我院新生兒MB及NGS檢測臨床常規(guī) 臨床發(fā)現(xiàn)有肌張力低下或肌無力的表現(xiàn)(四肢松軟、呼吸困難、吸吮無力、多發(fā)關(guān)節(jié)攣縮和吞咽困難等)，排除有明確嚴(yán)重感染、甲狀腺功能減退癥、低血糖、顱內(nèi)出血和脊髓占位病變等；待病情平穩(wěn)，完善分子核型篩查，排除染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常；病情危重，直接行MB及NGS檢測。MB醫(yī)囑由主治醫(yī)師決定。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 同時滿足以下條件：①2016年1月1日至2018年12月31日我院新生兒科住院病例；②完成MB和NGS檢測；③臨床發(fā)現(xiàn)+MB或NGS確診NMDs。

1.3 資料截取 從病歷資料中截取患兒的臨床信息：家族史(近親結(jié)婚，流產(chǎn)、死胎)，產(chǎn)前病史(胎動減少、羊水過多及羊水過少)，出生史(性別、孕周、出生體重、Apgar評分和分娩方式)，新生兒期病史(呼吸支持方式、喂養(yǎng)方式、合并其他畸形等)，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果[磷酸肌酸激酶(CK)、乳酸、血氨]，MB病理報告，NGS檢測結(jié)果及出院情況。

1.4 NGS及陽性結(jié)果分類 本文病例樣本處理、測序、變異分析和結(jié)果解讀均參照我院分子診斷中心建立的高通量測序數(shù)據(jù)分析和臨床診斷流程2.0[7]。選用Agilent ClearSeq Inherited Disease試劑盒(包含2 742個已知致病基因)。測序試驗(yàn)采用Illumina Hiseq平臺，與人類參考基因組序列比對，98%的目標(biāo)捕獲區(qū)域測序深度>20×。變異采用VEP軟件(Variant Effect Predictor, Ensembl 73)進(jìn)行注釋。3個主要的收錄已知或疑似致病變異的數(shù)據(jù)庫ClinVar、OMIM和HGMD用于篩選已知的致病變異，同時采用多種工具預(yù)測錯義變異的危害性、注釋非編碼區(qū)序列等?；谌巳旱拇笠?guī)模測序數(shù)據(jù)庫用于排除在正常人群中具有較高頻率的變異。變異使用Clinic Sequence Analyzer(CSA, WuXi NextCODE)進(jìn)行評估，并依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)發(fā)布的《序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南》對每個變異進(jìn)行分類。變異按照人類基因組變異協(xié)會(HGVS)規(guī)則進(jìn)行命名。陽性變異采用Sanger測序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 MB病理檢測 無菌操作下，行肱二頭肌或股四頭肌肌肉活檢。將新鮮肌肉組織標(biāo)本在液氮預(yù)冷的異戊烷中固定，冰凍切片。常規(guī)進(jìn)行組織化學(xué)染色(HE、改良Gomori三色、ORO、PAS)，酶組織化學(xué)染色(NADH-TR、SDH、COX、SDH/COX、ATPase、NSE、ACP、AMP等)和免疫組織化學(xué)染色(行Alexa Fluor 555和FITC標(biāo)記分別的dystrophin、α、β、γ、δ-Sarcoglycan、Lamininα2、Caveolin-3、Dysferlin及Collagen Ⅵ等單克隆抗體染色)。

1.6 預(yù)后 以患兒出院時是否存活為判斷預(yù)后的結(jié)局指標(biāo)；因各種因素自動出院的患兒，電話隨訪患兒的存活狀況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)表示，計(jì)數(shù)資料以百分比(%)表示。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 25例NMDs納入本文分析。男14例，女11例。早產(chǎn)9例，足月16例；順產(chǎn)10例，剖宮產(chǎn)15例；孕周27+4～41+5(中位數(shù)38+3)周，出生體重980～4 050(中位數(shù) 3 000)g。住院時間2～105(中位數(shù)30)d，行肌肉活檢為生后2～114(中位數(shù)21)d，行肌肉活檢時的糾正胎齡32+1～51+4(中位數(shù)41+3)周。

2.2 臨床發(fā)現(xiàn) 產(chǎn)前檢查發(fā)現(xiàn)胎動減少2例(8%)，羊水過多10例(40%)。特殊面容5例(20%)，合并其他畸形6例(24%)。1 min Apgar評分≤7分13/23例(56.5%)。肌張力低下24例(96%)。需呼吸支持22例(88%)，其中有創(chuàng)呼吸支持13例(52%)，無創(chuàng)呼吸支持9例(36%)。3例禁食狀態(tài)，需鼻飼喂養(yǎng)20/22例(90.9%)，2例經(jīng)口喂養(yǎng)。神經(jīng)肌肉相關(guān)疾病16例(64%)，其中先天性肌病11例、先天性強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良2例、先天性肌營養(yǎng)不良1例、線粒體肌病2例；遺傳代謝性疾病4例(16%)；神經(jīng)肌肉接頭疾病2例(8%)；脊髓前角運(yùn)動細(xì)胞病變2例；心臟疾病1例(表1)。

2.3 實(shí)驗(yàn)室檢查 2例CK明顯升高(例13 和25分別為20 104和4 740 IU·L-1)，23例CK正?；蜉p度升高；5例(例4、11、13、22和24)血氨>200 μmol·L-1，2例(例20和22)血乳酸>10 mmol·L-1。

2.4 MB病理報告和NGS檢測結(jié)果 MB病理陽性19例(76.0%)：先天性肌病10例，強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、脊髓性肌萎縮癥(SMA)、類型待定各2例，先天性肌營養(yǎng)不良、先天性肌無力綜合征和線粒體肌病各1例。NGS檢測陽性23例(92%)：NMDs相關(guān)基因14例(56%)，其中先天性肌病相關(guān)基因9例(MTM13例，RYR1、ACTA1各2例，TTN、NEB各1例)，先天性肌營養(yǎng)不良1例(LAMA2)，先天性強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良2例(DMPK)，線粒體肌病基因2例(mtDNA、CPT2各1例)；遺傳代謝性疾病相關(guān)基因4例(LYST2例、PEX1、MOCS1各1例)；SMA 2例(SMN1)；先天性肌無力綜合征2例(SCN4A、CHRNA1各1例)；心臟相關(guān)基因1例(KCNH2)。

2.5 預(yù)后 死亡15例(60%)，存活8例(32%)，失訪2例(8%)。

死亡患兒中NGS檢測陽性13/15例(86.7%)：神經(jīng)肌肉疾病相關(guān)基因8例(其中MTM13例，ACTA1、TTN、DMPK、mtDNA和CPT2各1例)，LYST2例，SCN4A、SMA和KCNH2各1例。

表1 25例經(jīng)肌肉疾病患兒的臨床資料

死亡患兒MB病理陽性11/15例(73.3%)：先天性肌病6例，類型待定2例，強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、SMA和線粒體肌病各1例。

NGS檢測和MB病理均陽性9/15例(60%)。2例失訪(例24和25)，出院時均有氧依賴。例24有不良家族史，系G2P2，第1胎生后20余天因肌張力低下死亡，其MB病理和NGS檢測提示先天性肌病(RYR1突變)，出院時需鼻飼喂養(yǎng)。例25的MB病理和NGS檢測提示先天性肌營養(yǎng)不良(LAMA2突變)。

3 討論

NMDs是周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)異常導(dǎo)致的一組異質(zhì)性疾病，涉及運(yùn)動神經(jīng)元、周圍神經(jīng)、神經(jīng)肌肉接頭或骨骼肌，可能累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其他臟器(如心臟、肝臟等)?？捎谛律鷥骸和虺赡昶诎l(fā)病，部分疾病呈漸進(jìn)性過程[1]。脊髓前角運(yùn)動細(xì)胞病變、先天性神經(jīng)病變、神經(jīng)肌肉接頭疾病、各種類型的肌病及遺傳代謝性疾病等均有相似的臨床表現(xiàn)，新生兒期起病的臨床表現(xiàn)呈非特異性，僅靠臨床很難確診，常易誤診或漏診，對患兒及其家庭和公共衛(wèi)生造成極大負(fù)擔(dān)。

本文納入病例的標(biāo)準(zhǔn)之一為完成MB，Prader-Willi綜合征的患兒在新生兒期雖也有相似的臨床表現(xiàn)，但通過甲基化-特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MS-PCR)可確診，無需常規(guī)行MB檢查，故予排除。本文包括了如下類型疾病：SMA、神經(jīng)肌肉接頭疾病(先天性肌無力綜合征)、神經(jīng)肌肉相關(guān)疾病(先天性肌病、先天性肌營養(yǎng)不良、先天性強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、線粒體肌病)和遺傳代謝性疾病(溶酶體貯積病、過氧化物酶體病、鉬輔因子缺乏)。NMDs以神經(jīng)肌肉相關(guān)疾病為主(64%)，其次為遺傳代謝性疾病(16%)。神經(jīng)肌肉相關(guān)疾病中又以先天性肌病為主(11/16例，68.8%)。本研究例17以呼吸急促起病，臨床表現(xiàn)為肌張力低下、吞咽功能差、心功能不全伴心律失常(Ⅰ度房室傳導(dǎo)阻滯)，心超提示心肌肥厚，由于存在心臟受累，NMDs不能除外，MB未及異常，NGS檢測提示KCNH2基因突變(長QT綜合征)。

詳細(xì)的病史詢問、體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查可縮小診斷范圍。除外中樞性病因(如膽紅素腦病、腦發(fā)育畸形等)，有如下陽性體征：①對稱性、近端或遠(yuǎn)端肌無力，②面部肌無力或吞咽困難，③原始反射減弱或消失；以及診斷性檢查(CK明顯升高、肌電圖、MB或肌肉MRI成像)有助于定位PNS[2]。新生兒神經(jīng)系統(tǒng)處于發(fā)育階段，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀易受多因素干擾，腱反射不易引出，很難區(qū)分是否為肌力或肌張力異常，依據(jù)體格檢查很難進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)的定位和定性診斷，臨床工作中更多的是通過臨床癥狀(如驚厥、意識障礙等)來評估是否為中樞或周圍性疾病。新生兒期NMDs臨床癥狀缺乏特異性，NMDs在不同時期的臨床表現(xiàn)各異?；純寒a(chǎn)前檢查異常包括胎動減少或消失；由于胎兒吞咽功能受累，常提示羊水過多。新生兒期典型的臨床表現(xiàn)為肌張力低下、肌無力(全身性或局灶性)、多發(fā)性攣縮(關(guān)節(jié)攣縮)、呼吸衰竭和吞咽困難，常需呼吸支持及鼻飼喂養(yǎng)，部分病例可有“肌病面容”：面部狹長、長頭癥、高腭弓及上瞼下垂[8]。由于產(chǎn)前呼吸肌運(yùn)動不良，胸部X線提示肋骨菲薄。先天性肌營養(yǎng)不良實(shí)驗(yàn)室檢查常提示CK升高[9]。英國[10]的一項(xiàng)單中心研究回顧性分析了125例先天性肌病患兒的自然病程，76%在新生兒期/嬰兒期出現(xiàn)臨床癥狀，30.4%出生時需呼吸支持，25.2%需鼻飼喂養(yǎng)。本文發(fā)現(xiàn)新生兒期NMDs最常見的臨床表現(xiàn)為肌張力低下(96%)、吞咽困難(90.9%)及呼吸困難(88%)，排除中樞性、內(nèi)分泌性及圍生期損傷等因素后，當(dāng)患兒出現(xiàn)上述臨床表現(xiàn)時，需高度懷疑NMDs。

MB通過形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)和超微結(jié)構(gòu)分析，對病變肌肉做出明確的病理診斷。在先天性肌病中，依據(jù)特征性的病理改變進(jìn)行分型[11]。在無法明確遺傳病因時，MB可能會有所幫助。泰國的一項(xiàng)回顧性研究納入了92例疑似NMDs患兒，MB陽性率為80%，常見的病理類型為肌病(71.6%)，無操作相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生[12]。Maggi等[13]報告了66例先天性肌病的患兒，MB陽性率為81.8%，常見的病理類型是軸空性肌病(54%)。本文MB陽性率76%，常見的病理類型為先天性肌病(52.6%)，且無操作相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生。由于樣本例數(shù)偏少，無法進(jìn)行亞型分析。部分NMDs在新生兒期MB無異常表現(xiàn)，當(dāng)臨床高度疑似NMDs，而MB為陰性結(jié)果時，常需要NGS來進(jìn)一步協(xié)助診斷。

精準(zhǔn)的基因診斷對NMDs患兒的治療選擇、預(yù)后評估及家系的遺傳咨詢均非常重要。MB曾是先天性肌病和先天性肌營養(yǎng)不良診斷的主要手段，隨著NGS的日益普及，如果病史和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果與基因檢測結(jié)果一致，可能不再需要MB這種有創(chuàng)性的操作[9]。一些特定的疾病，如線粒體肌病、SMA、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良和面肩肱型肌營養(yǎng)不良(FSHD)，基因檢測將取代MB[14]。Maggi等[13]的研究表明66例先天性肌病的患兒，NGS陽性率為66.7%，最常見的基因突變?yōu)镽YR1(54%)。英國[10]一項(xiàng)回顧性研究分析了125例先天性肌病患兒的自然病程，最常見的致病基因?yàn)镽YR1(44.4%)，突變基因?yàn)镽YR1、NEB、SEPN1的患兒全部存活；死亡患兒中最常見的突變基因?yàn)锳CTA1、MTM1、KLHL40。中國[15]409例先天性肌營養(yǎng)不良(CMD)的多中心回顧性調(diào)查表明，最常見的基因突變類型為LAMA2(36.4%)。Wang等[16]納入了214例新生兒肌張力低下患兒，NGS診斷的陽性率為22.5%，NGS結(jié)合傳統(tǒng)的篩查方法(如染色體核型分析、遺傳代謝性疾病的串聯(lián)質(zhì)譜分析、Sanger測序、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)及MS-PCR)，肌張力低下的確診率可提高至62.9%。本文NGS檢測陽性率為92%，以先天性肌病相關(guān)基因?yàn)橹?39.1%)。

目前診斷NMDs尚無明確的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究中MB病理陽性的病例有2例NGS結(jié)果陰性(10.5%)。NGS陽性的病例中MB病理陰性為16例(26.1%)。部分代謝性肌病臨床早期診斷可盡早采取干預(yù)措施，改善預(yù)后[1]。MB屬于微創(chuàng)操作，可在短期內(nèi)做出病理診斷，且無操作相關(guān)的不良反應(yīng)。既往基因解讀報告所需時間較長。隨著3代基因測序技術(shù)的開展，可能會縮短基因報告的時間，可先行基因檢測[17]。

目前NMDs多無特異性的治療方法，主要是針對肌無力所引起的并發(fā)癥給予對癥支持治療。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展以及基因治療的興起，已有部分神經(jīng)肌肉疾病如SMA治療的病例報道。2016年12月美國FDA核準(zhǔn)Nusinersen作為治療兒童和成人SMA的首個藥物[18]。目前已有多篇研究表明Nusinersen能改善SMA患兒的臨床癥狀[19, 20]。

本研究不足和局限性：納入的研究對象為單中心同時行MB及NGS檢測的患兒，病例少且來源較單一，肌病分類復(fù)雜，無法進(jìn)行亞組分析。

綜上所述，臨床高度疑似NMDs的患兒，通過詳細(xì)的病史詢問、體格檢查及常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查，結(jié)合MB病理診斷和NGS檢測，能極大提高新生兒期NMDs的確診率。對于因病情危重死亡的患兒來說，明確診斷可能有助于家庭再生育時進(jìn)行產(chǎn)前咨詢。新興治療策略的出現(xiàn)將為診治NMDs帶來希望。