劉子薇，謝林辰，靳羽含，秦雯，厲妲

(北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100094)

七厘散首次出現(xiàn)在清代作者謝元慶撰寫的《良方集腋·損傷門》一書中，又被稱作是神效七厘散，意為治療效果非常好。方中含有紅花、沒藥、朱砂、麝香、血竭、冰片、乳香等中藥。氣香，味辛、苦，有清涼感[1]。紅花(CarthamustinctoriusL.)，菊科植物的干燥花，在活血祛瘀類中藥中使用較為廣泛。其性溫、味辛[2]，歸心、肝經(jīng)。具有活血通經(jīng)，祛瘀止痛之效，主要用于治療女性的經(jīng)期病、胸痛、瘀傷、身體酸痛等病癥[3]。

七厘散既可以口服，也可以外用敷在傷處[4]?，F(xiàn)如今七厘散在傷科中逐漸被廣泛應(yīng)用，它不僅可以化去瘀癥消去腫塊，也可以止痛止血[5]。臨床上常常用于跌倒損傷、皮外出血。

花粉粒，在紅花粉末中的顯微特征相對明顯和穩(wěn)固，它的優(yōu)點是數(shù)目很多，在計算數(shù)量上有一定優(yōu)勢，能夠方便于在顯微鏡下進行顯微定量。紅花花粉粒的特點有以下幾方面：顏色上是深黃色，在眾多顯微特征中顏色突出方便查找，形狀上多數(shù)是類圓球形、橢圓形或橄欖形，外壁上有短刺和疣狀雕紋，具有3個萌發(fā)孔，孔口的形狀是類圓形或長圓形[6]。

在國家藥品標準中，中成藥的質(zhì)量是否達標是很重要的一部分，由于中成藥的種類甚多，組成成分相對繁雜，依照現(xiàn)在的統(tǒng)一標準對其質(zhì)量的評價都不是很全面，范圍仍局限在中成藥中某單味或多味中藥的有效成分的鑒別和檢測。近年來，中成藥顯微定量的研究已增多，逐步成為中成藥質(zhì)量是否符合標準的參照依據(jù)[7]。

中藥顯微定量法是利用中藥中某種顯微特征具有固定常數(shù)的特點，對其進行容量或者重量分析，從而得出中藥百分含量的一種中藥鑒定方法[8]。利用顯微特征常數(shù)來測定中藥含量的方法具有簡便、快速、精確、成本較低等特點，此法更適用于廣大基層，且近年來已逐步運用到中成藥的質(zhì)量評價。

1 試驗儀器、試劑與藥品

1.1 儀器 顯微鏡：Olympus顯微攝影系統(tǒng)，包括：BX-51研究級萬能顯微鏡，配備Olympus DP-72顯微鏡數(shù)碼相機(日本奧林巴斯株式會社)；電子分析天平(CP225D，德國賽多利斯集團)；TopPette型微量移液器(大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(FW80，天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試劑 水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，批號：20120321)；甘油(沈陽沈一精細化學(xué)品有限公司，批號：20160508)；試驗需要的水合氯醛試液依據(jù)《中國藥典》2015年版(四部)通則8002項下配制。

1.3 藥品 本研究所采用的紅花樣品均由北京城市學(xué)院厲妲老師鑒定為菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)的干燥花。七厘散來自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號分別為：2101015、2101027、2101008。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅花花粉粒的顯微特征常數(shù)測定方法條件的優(yōu)選 試驗中干擾紅花粉末樣品混懸效果的重要因素有：X1樣品紅花的重量；X2過篩的目數(shù)也叫作粉碎粒度；X3混懸劑甘油的劑量。因此本試驗采用均勻設(shè)計的方案來確定紅花花粉粒的顯微特征常數(shù)值的檢測條件?？紤]幾種因素對試驗結(jié)果的影響，本試驗利用U6(63)均勻設(shè)計方案[7-10]對其進行考察。

將紅花樣品分為6組，每組對應(yīng)的樣品重量分別為5.00、9.99、15.01、19.98、25.02、30.03 mg；每組對應(yīng)的樣品粉碎粒度分別為80、100、100、80、80、100目；每組對應(yīng)加入的甘油量分別為5.0、8.0、4.0、7.0、3.0、6.0 mL。

取紅花樣品進行粉碎，按照均勻設(shè)計表逐一過80目篩、100目篩，讓其全數(shù)過篩。精密稱定5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 mg共6份，將水合氯醛試液依次倒入，經(jīng)數(shù)次研磨后，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，再依次倒入5.0、8.0、4.0、7.0、3.0、6.0 mL的甘油，最終使用水合氯醛試液進行定容。

裝片所需的體積：經(jīng)過預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，樣品的裝片體積對紅花的花粉粒顯微特征常數(shù)無顯著影響，因此可按照試驗需要選擇裝片所需的體積；考慮到被觀察物要鋪滿整個蓋玻片并不能溢出，經(jīng)反復(fù)取樣驗證，最終選擇0.02 mL來裝片，每份溶液平行裝片50張后，放在顯微鏡下觀看紅花的花粉粒并計數(shù)。

把50張片子的計數(shù)結(jié)果隨機化分為5組(每組10張)，計算出每組片子中紅花花粉粒數(shù)目的平均值，然后算出5組數(shù)據(jù)的平均值和其5組數(shù)據(jù)的RSD值，用每組紅花樣品平均值的RSD值為考查指標，通過SPSS 19.0軟件得出均勻設(shè)計的優(yōu)化結(jié)果。試驗數(shù)據(jù)見表1。

表1 紅花中花粉粒顯微特征常數(shù)均勻設(shè)計試驗結(jié)果

均勻設(shè)計軟件算出的結(jié)果:Y=9.428-0.221X1；R2=0.976；F=162.779；Ymin=2.798(即2.80%)。

X1項為負，所以X1要取最大值；X2、X3沒有進入方程式，說明X2、X3對試驗的結(jié)果影響可以不用考慮，X2、X3的值可根據(jù)實際情況進行條件選擇。

即紅花樣品的優(yōu)化條件為X1樣品的重量:30.0 mg；X2粉碎的粒度:100目;X3加入的甘油量:6 mL。

驗證均勻設(shè)計試驗：紅花樣品粉末3份(每份30.0 mg并過100目篩)，精確稱定后通過水合氯醛試液進行數(shù)次研磨，到轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，倒入甘油6 mL，最終通過水合氯醛試液進行定容，完全搖勻后精確吸取0.02 mL所配的紅花樣品溶液，平行制片50張，于顯微鏡下查看紅花的花粉粒并計數(shù)，將所得數(shù)據(jù)隨機化分為5組，算出每一組數(shù)據(jù)的RSD值。

驗證成果中，3份紅花的花粉粒特征常數(shù)平均值分別為：60.50、59.84、60.36 個/mg，優(yōu)化條件給出的最小RSD是2.80%，各樣品的RSD各自為2.74%、2.54%、2.72%，每一份樣品的RSD都不超過優(yōu)化條件列出的最小RSD(2.80%)，說明本均勻試驗設(shè)計方案合理。下文紅花中花粉粒顯微常數(shù)測定試驗都根據(jù)均勻設(shè)計給出的優(yōu)化成果來操作。

2.2 紅花花粉粒顯微特征常數(shù)值測定 30.0 mg精確稱取紅花重量后根據(jù)均勻設(shè)計方法，察看并記錄每張片子中紅花花粉粒的數(shù)量。取其數(shù)目平均值，根據(jù)公式1計算紅花花粉粒顯微特征常數(shù)值。結(jié)果見表2。

表2 紅花樣品花粉粒顯微特征常數(shù)值測定結(jié)果

公式1：顯微特征常數(shù)P=(X×V)/(V′×W)，這當(dāng)中，P 表示定量藥物的顯微特征常數(shù)，單位是(個/mg)；X 表示每片蓋玻片下藥物的顯微特征數(shù)；V 表示定量藥物混懸液的總體積，單位是(mL)；V′ 表示蓋玻片下藥物混懸液的體積，單位是(mL)；W 表示藥物的重量，單位是(mg，以干燥品計)。

根據(jù)公式1，依照均勻設(shè)計驗證試驗的成果可計算出紅花花粉粒的顯微特征常數(shù)值為2 807.19個/mg。

2.3 七厘散中紅花的含量檢測 中成藥前處理：將七厘散粉碎后直到全部過100目篩，備用。

為防止結(jié)果出現(xiàn)誤差，用于顯微定量的藥材及中成藥應(yīng)按干燥品計算。七厘散樣品按照《中國藥典》2015年版中的烘干法[1]來測定：取經(jīng)過粉碎后的七厘散粉末 2～5 g，平鋪在干燥且重量恒定的稱量瓶中，厚度不大于 5 mm，精確稱取后，移放至烘箱中，打開瓶蓋，溫度設(shè)置 80 ℃干燥 5 h，將瓶蓋蓋好，冷卻 30 min，精確稱取重量后，再用上述溫度干燥 1 h，冷卻，稱重，直到接連兩次重量的差異少于5 mg 為止。依照減失的重量，算出供試品中的含水量(%)。具體含量見表3。

表3 3種七厘散樣品水分測定

將七厘散粉碎后直至完全過100目篩，精確稱取干燥后的中成藥的粉末200 mg各3份，按照均勻設(shè)計方法制片，記錄花粉粒顯微特征數(shù)，按照公式2算出紅花百分含量，試驗結(jié)果見表4。

表4 七厘散中紅花花粉粒的顯微定量測定

公式2：樣品含量%=(X×V)/(V′×W×P)×100%

X表示每片蓋玻片下藥物顯微特征常數(shù)；V 表示定量藥物混懸液總體積(mL)；V′表示蓋玻片下藥物混懸液體積(mL)；W表示藥物重量(mg，按干燥品計)；P表示定量藥物顯微特征常數(shù)(個/mg)。

3 討論與結(jié)論

相較于其他鑒別方法來說，顯微鑒別具有所需費用低、執(zhí)行方法簡單、易于操作且普及效果明顯等特點[11]。目前我國顯微測定技術(shù)發(fā)展較為成熟，從20世紀80年代起就已經(jīng)有了顯微研究的相關(guān)報道，但對于中藥材應(yīng)用尤其是含有紅花的中成藥方面的顯微定量研究少之又少，且試驗設(shè)計較為凌亂，沒有一套準確可行的完整步驟，目前使用較廣的非參比物顯微定量法在傳統(tǒng)顯微操作方法的基礎(chǔ)上加以改革創(chuàng)新，建立起了一套符合中藥材鑒別特點的顯微方法與思路，可有效檢測有效成分不明的中藥材。本試驗應(yīng)用均勻試驗設(shè)計顯微檢測方法，有著高度的可推廣性與相對準確性。

本次試驗將紅花作為參照對象，紅花由于粉碎后過100目篩，有的花粉粒較完整，有的已破碎。觀察時對完整的花粉粒計為一個單位；破碎的花粉粒大于1/2計為一個單位；其他情況忽略不計[12]。對七厘散中的紅花含量進行有效性檢測。檢測結(jié)果表明，收集的七厘散中紅花的含量符合《中國藥典》的標準。應(yīng)用此檢測方法可以為含有紅花其他中成藥質(zhì)量評價提供新的技術(shù)，簡便、迅速地判斷是否含有相應(yīng)中藥材且含量是否充足，可為七厘散及含有紅花的中成藥質(zhì)量評價提供新的研究思路和方法。