楊嬌，范海貞，阮鈴杰，馮停停，葉淼,2

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建省中藥資源研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122)

黃毛耳草(Hedyotischrysotricha)是茜草科(Rubiaceae)耳草屬(Hedyotis)植物黃毛耳草的全草，廣泛分布于江西、福建、浙江、江蘇等地[1]。黃毛耳草收錄于福建省、浙江省及江蘇省的地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)[2-4]。中醫(yī)理論認(rèn)為該藥材具有清熱除濕、消腫解毒、活血舒筋之功效，臨床上主要用于治療急性肝炎、腎炎水腫、腸炎、痢疾、跌打腫痛等[1]。此外，黃毛耳草為腸炎寧片、傷濕丸等多個(gè)國藥準(zhǔn)字中藥成方制劑的主要組方藥材。目前已報(bào)道的黃毛耳草的化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜苷、三萜、黃酮、甾醇、生物堿等[5-6]。其中槲皮素、烏蘇酸及雞屎藤苷甲酯的含量測(cè)定方法已見報(bào)道[5]。2012年，葉淼等[6]從黃毛耳草中共分離得到5個(gè)化合物，包括1個(gè)甾醇[(24R)-stigmastane-3β,5α,6β-triol]，3個(gè)三萜(烏蘇酸、坡模酸、3β,6β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid)及1個(gè)環(huán)烯醚萜苷(雞屎藤苷甲酯)；基于前期研究基礎(chǔ)，本文報(bào)道了黃毛耳草14個(gè)化學(xué)成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定。其中7個(gè)化合物(1～3、6、7、12、13)為耳草屬植物中首次分離，14曾在同屬植物脈耳草(H.vestita)中得到[7]，但為首次從黃毛耳草中分離。同時(shí)，本文采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)方法對(duì)本次分離得到的主要成分車葉草苷和京尼平苷進(jìn)行含量測(cè)定。

1 設(shè)備與材料

1.1 設(shè)備 LC-20A分析兼半制備高效液相色譜儀(配SPD-M20A二極管陣列及Sedex-85型ELSD檢測(cè)器，日本島津公司)；YMC-pack ODS-A色譜柱(4.6/10 mm×250 mm,5 μm)；Bruker Daltonics micrOTOF-QⅡ質(zhì)譜儀、Bruker AVANCE DRX-500核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；柱層析硅膠、薄層色譜硅膠GF254(青島海洋化工廠)；MCI微孔樹脂(CHp20p，75～150 μm，日本三菱)；柱色譜試劑均為分析純(中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)。AR224CN電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；KQ-500DE型醫(yī)院數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國Millipore公司)；TD5A-WS醫(yī)用離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。

1.2 材料 10批次黃毛耳草藥材采集于安徽省亳州藥材市場，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為茜草科植物黃毛耳草(H.chrysotricha)的干燥全草。其中批次為100115用于柱色譜分離用，其他批次用于含量測(cè)定分析，所有樣本保存于福建中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)標(biāo)本實(shí)驗(yàn)室。車葉草苷和京尼平苷自制，純度經(jīng)HPLC-DAD大于98%，供含量測(cè)定用；色譜級(jí)甲醇(德國默克公司)；色譜純甲酸(批號(hào)：A1309012，上海阿拉丁試劑有限公司)；色譜純?nèi)宜?批號(hào)：8996174，北京迪馬科技發(fā)展中心)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離 將黃毛耳草(10.0 kg)全草以甲醇為溶劑進(jìn)行熱回流提取4次(4×20.0 L×6 h)。濃縮后，得甲醇提取物(500.3 g)。醇提物經(jīng)硅膠柱梯度洗脫(CH2Cl2/MeOH，60∶1、40∶1、30∶1、15∶1、9∶1、5∶1、2∶1、0∶1)，得到7個(gè)組分Fr.1～7。其中Fr.2經(jīng)硅膠柱，以石油醚(PE)/EtOAc(4∶1)洗脫，得4(67.02 mg)、5(125.78 mg)。Fr.3經(jīng)硅膠柱色譜，CH2Cl2/EtOAc(20∶1→10∶1)梯度洗脫，得8(12.65 mg)、7(15.74 mg)。Fr.6經(jīng)硅膠柱色譜，CH2Cl2/EtOAc(20∶1→10∶1)梯度洗脫，得3個(gè)亞組分Fr.6A～6C，其中Fr.6B經(jīng)半制備高效液相色譜(乙腈/水/TFA，95∶5∶0.1；流速：3 mL·min-1)，得2(8.95 mg，tR= 43.3 min)及1(13.42 mg，tR= 48.13 min)。Fr.6C經(jīng)MCI柱色譜(MeOH/H2O，85∶15)和Sephadex LH-20柱色譜(CH2Cl2/MeOH，2∶1)純化，得3(8.56 mg)和6(12.68 mg)。Fr.7經(jīng)硅膠柱(EtOAc/EtOH，15∶1、10∶1、5∶1、2∶1、0∶1)，得5個(gè)亞組分Fr.7A～7E；Fr.7B經(jīng)MCI柱色譜(1∶1→9∶1，MeOH/H2O)得到9(2.23 g)、11(267.28 mg)和12(17.83 mg)。Fr.7D經(jīng)反復(fù)硅膠柱分離(CH2Cl2/MeOH/H2O，4∶1，3∶1，2∶1)，并用Sephadex LH-20(MeOH)純化，得到10(11.85 mg)、13(14.66 mg)和14(16.37 mg)。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1：無色結(jié)晶(甲醇)，ESIMSm/z：471 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,pyridine-d5)δ:4.86(1H,m,H-3),4.16(1H,brs,H-6),2.96(1H,t,J=12.5 Hz,H-4a),2.33(1H,overlapped,H-4b),1.65(3H,s,H3-19),0.99(3H,d,J=6.4 Hz,H3-21),0.90(3H,t,J=7.3 Hz,H3-29),0.88(3H,d,J=6.6 Hz,H3-26),0.85(3H,d,J=6.6 Hz,H3-27),0.75(3H,s,H3-18);13C-NMR(125 MHz,pyridine-d5)δ:32.2(C-1),33.00(C-2),67.0(C-3),42.5(C-4),75.5(C-5),75.9(C-6),35.4(C-7),30.9(C-8),45.6(C-9),38.8(C-10),21.4(C-11),40.3(C-12),42.7(C-13),56.2(C-14),24.3(C-15),28.3(C-16),56.2(C-17),12.0(C-18),16.9(C-19),36.2(C-20),19.6(C-21),33.9(C-22),26.1(C-23),45.7(C-24),29.1(C-25),19.6(C-26),18.9(C-27),23.0(C-28),11.8(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8]，故推測(cè)1極可能為(24R)-stigmastane-3β,5α,6β-triol。然其C-24的絕對(duì)構(gòu)型仍需進(jìn)一步確定。前人研究表明[9]，甾醇類A～C環(huán)結(jié)構(gòu)的改變對(duì)于側(cè)鏈碳原子的NMR數(shù)據(jù)影響甚微。且可根據(jù)側(cè)鏈碳原子(尤其是C-23～C-27)的碳譜特征來確定C-24的絕對(duì)構(gòu)型，從而區(qū)分24R/S差向異構(gòu)體。1的C-23～C-27的碳譜數(shù)據(jù)(δ26.1,45.7,29.1,19.6,18.9)與sitosterol的(δ26.1，45.9，29.2，19.8，19.1)高度一致，而與sitosterol的24S差向異構(gòu)體clionasterol的C-23～C-27碳譜數(shù)據(jù)(δ26.4，46.1，29.0，19.1，19.6)有明顯差異，故將1的C-24絕對(duì)構(gòu)型定為R，而化合物1最終確定為(24R)-stigmastane-3β,5α,6β-triol。

化合物2：白色結(jié)晶(氯仿/甲醇，2∶1)，ESIMSm/z:469 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,pyridine-d5)δ:5.19(1H,dd,J=15.0,9.2 Hz,H-22 or H-23),5.04(1H,dd,J=15.5,9.1 Hz,H-22 or H-23),4.87(1H,m,H-3),4.16(1H,brs,H-6),2.98(1H,t,J=12.5 Hz,H-4a),2.33(1H,overlapped,H-4b),1.66(3H,s,H3-19),1.08(3H,d,J=6.5 Hz,H3-21),0.89(3H,overlapped,H3-27),0.87(3H,overlapped,H3-29),0.84(3H,overlapped,H3-26),0.76(3H,s,H3-18);13C-NMR(125 MHz,pyridine-d5)δ:31.2(C-1),32.4(C-2),66.1(C-3),41.2(C-4),74.9(C-5),74.4(C-6),34.8(C-7),30.5(C-8),44.9(C-9),38.3(C-10),21.1(C-11),40.2(C-12),42.8(C-13),56.4(C-14),24.3(C-15),29.0(C-16),55.8(C-17),12.8(C-18),16.8(C-19),40.4(C-20),21.3(C-21),138.6(C-22),129.1(C-23),51.0(C-24),31.8(C-25),21.3(C-26),19.2(C-27),25.2(C-28),12.4(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定2為24ξ-ethylcholest-22E-ene-3β,5α,6β-triol。

化合物3：白色粉末(氯仿)，ESIMSm/z:453 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ:5.59(1H,dd-like,J=5.2,1.4 Hz,H-6),3.83(1H,d,J=7.8 Hz,H-7),3.57(1H,m,H-3),0.98(3H,s,H3-19),0.91(3H,d,J=6.7 Hz,H3-21),0.83(3H,t,J=7.4 Hz,H3-29),0.81,0.79(each 3H,d,J=6.9 Hz,H3-26,27),0.67(3H,s,H3-18)；13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ:37.1(C-1),31.6(C-2),71.5(C-3),41.9(C-4),143.5(C-5),125.3(C-6),73.4(C-7),39.6(C-8),48.4(C-9),36.5(C-10),21.8(C-11),42.9(C-12),41.0(C-13),55.8(C-14),26.4(C-15),28.3(C-16),55.4(C-17),11.9(C-18),19.2(C-19),36.2(C-20),19.0(C-21),33.9(C-22),26.2(C-23),45.9(C-24),29.2(C-25),19.8(C-26),18.9(C-27),22.8(C-28),12.0(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)高度相似[11]，推斷化合物3可能為5-stigmasten-3β,7β-diol。與1情況類似，3的C-23～C-27的碳譜數(shù)據(jù)特征與sitosterol[9]高度一致，故C-24為R，3確定為5-stigmasten-3β,7β-diol。

化合物4：無色針狀結(jié)晶(氯仿)，ESIMSm/z:437 [M+Na]+。用TLC法于多種溶劑系統(tǒng)(石油醚/丙酮，6∶1；石油醚/乙酸乙酯，4∶1；環(huán)己烷-異丙醇，7∶1)分別展開，4與豆甾醇對(duì)照品Rf值及斑點(diǎn)顏色均一致，故鑒定4為豆甾醇。

化合物5：無色針狀結(jié)晶(氯仿)，ESIMSm/z:437 [M+Na]+。用TLC方法于多種溶劑系統(tǒng)(石油醚-丙酮、三氯甲烷-甲醇、環(huán)己烷-乙酸乙酯)分別展開，化合物5與β-谷甾醇對(duì)照品Rf值及斑點(diǎn)顏色均一致，故鑒定化合物5為β-谷甾醇。

化合物6：白色粉末(甲醇)，ESIMSm/z:527 [M+Na]+。經(jīng)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的碳譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照，將6最終確定為hyptatic acid B。然而，前人文獻(xiàn)中僅報(bào)道了該化合物特征信號(hào)的1H-NMR數(shù)據(jù)(H-2β、3α、5α、12、18β；H2-24；Me-23、25～27、29、30),而完整的氫譜數(shù)據(jù)未見報(bào)道。本文通過綜合分析化合物的HSQC和HMBC數(shù)據(jù)，完整歸屬了氫譜數(shù)據(jù)。具體見表1及圖1。

表1 化合物6(CD3OD)的1H-NMR、13C-NMR及HMBC相關(guān)數(shù)據(jù)

圖1 化合物6的結(jié)構(gòu)式以及關(guān)鍵HMBC相關(guān)

化合物7：白色針狀固體(氯仿/甲醇，2∶1)，ESIMSm/z:495 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,pyridine-d5)δ:5.48(1H,m,H-12),4.86(1H,m,H-6),3.04(1H,m,H-3),1.27(3H,s,H3-23),1.24(3H,s,H3-27),1.10(3H,s,H3-26),1.04(3H,s,H3-24),1.02(3H,d,J=6.2 Hz,H3-30),0.97(3H,J=6.6 Hz,H3-29),0.91(3H,s,H3-25)；13C-NMR(125 MHz,pyridine-d5)δ:37.1(C-1),23.4(C-2),78.3(C-3),36.7(C-4),56.0(C-5),67.2(C-6),41.2(C-7),40.1(C-8),48.2(C-9),39.0(C-10),23.4(C-11),125.7(C-12),138.3(C-13),42.6(C-14),28.3(C-15),24.6(C-16),47.7(C-17),53.3(C-18),39.1(C-19),39.2(C-20),30.8(C-21),41.1(C-22),28.4(C-23),18.5(C-24),16.9(C-25),17.2(C-26),23.7(C-27),179.5(C-28),17.7(C-29),21.1(C-30)。其NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13]，故將7定為6β-hydroxyursolic acid。

化合物8：白色粉末(氯仿)，ESIMSm/z:479 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CDCl3)δ:5.30(1H,brs,H-12),3.24(1H,dd,J=11.3,3.8 Hz,H-3α),2.91(1H,m,H-18),1.19(3H,s,H3-30),1.03(3H,s,H3-29),0.93(3H,s,H3-27),0.94(3H,s,H3-26),0.91(3H,s,H3-25),0.78(3H,s,H3-24),0.74(3H,s,H3-23)；13C-NMR(125 MHz,CDCl3)δ:38.4(C-1),27.1(C-2),78.4(C-3),38.5(C-4),56.2(C-5),18.3(C-6),32.8(C-7),39.1(C-8),47.5(C-9),36.6(C-10),22.6(C-11),122.1(C-12),143.6(C-13),41.3(C-14),27.6(C-15),23.2(C-16),46.2(C-17),41.0(C-18),45.8(C-19),30.3(C-20),33.5(C-21),32.3(C-22),27.8(C-23),15.2(C-24),15.5(C-25),16.4(C-26),25.6(C-27),180.2(C-28),32.8(C-29),23.3(C-30)。經(jīng)文獻(xiàn)對(duì)照[14]，鑒定8為齊墩果酸。

化合物9：白色晶體(甲醇)，ESIMSm/z:437 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.30(1H,d,J=2.0 Hz,H-3),5.99(1H,d,J=1.1 Hz,H-1),5.76(1H,d,J=1.6 Hz,H-7),5.59(1H,brd,J=6.5 Hz,H-6),4.76,4.67(1H×2,dd,J=14.3,1.3 Hz,H-10a,10b),4.71(1H,d,J=8.0 Hz,H-1),3.92(1H,dd,J=11.9,2.1 Hz,H-6a),3.67(1H,dd,J=12.0,6.4 Hz,H-6b),3.35-3.34(3H,overlapped,H-3,9,4),3.29(1H,t,J=9.0 Hz,H-5),3.19(1H,t,J=8.9 Hz,H-2),2.13(3H,s,CH3COO)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:93.3(C-1),150.3(C-3),106.2(C-4),37.5(C-5),86.3(C-6),128.9(C-7),144.3(C-8),45.2(C-9),60.9(C-10),172.6(C-11),100.1(C-1),74.6(C-2),78.3(C-3),71.5(C-4),77.9(C-5),62.8(C-6),172.2(CH3CO),20.6(CH3CO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15]，鑒定9為車葉草苷。

化合物10：無色針狀固體(甲醇)，ESIMSm/z:455 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.65(1H,s,H-3),5.99(1H,s,H-7),5.01(1H,d,J=8.5 Hz,H-1),4.94,4.80(1H×2,d,J=15.2 Hz,H-10a,10b),4.83(1H,overlapped,H-6),4.72(1H,d,J=7.85 Hz,H-1),3.84(1H,dd,J=12.5,2.4 Hz,H-6a),3.62(1H,dd,J=12.5,5.4 Hz,H-6b),3.38(1H,t,J=8.7 Hz,H-3),3.27-3.21(3H,m,H-4,5,2)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:101.6(C-1),155.1(C-3),42.7(C-5),75.4(C-6),131.9(C-7),145.9(C-8),46.3(C-9),63.9(C-10),172.5(C-11),100.8(C-1),75.2(C-2),78.8(C-3),71.8(C-4),78.1(C-5),63.3(C-6),171.2(CH3CO),20.9(CH3CO)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[15]，鑒定10為車葉草酸。

化合物11：白色粉末(甲醇)，ESIMSm/z:411 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.51(1H,s,H-3),5.80(1H,s,H-7),5.16(1H,d,J=7.6 Hz,H-1),4.71(1H,d,J=8.0 Hz,H-1),4.31(1H,brd,J=14.5 Hz,H-10a),4.18(1H,brdd,J=14.5,1.5 Hz,H-10b),3.86(1H,dd,J=11.5,3.5 Hz,H-6a),3.64(1H,dd,J=11.5,5.4 Hz,H-6b),3.39(1H,m,H-3),3.71(3H,s,COOCH3),3.29(1H,overlapped,H-4),3.29(1H,overlapped,H-5),3.22(1H,overlapped,H-5),3.22(1H,overlapped,H-2),2.80,2.09(1H,dd,H-6a,6b),2.72(1H,dd,J=8.0,7.5 Hz,H-9);13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:98.6(C-1),153.6(C-3),112.7(C-4),37.0(C-5),40.0(C-6),129.4(C-7),145.1(C-8),47.4(C-9),61.8(C-10),169.9(C-11),100.8(C-1),75.3(C-2),78.2(C-3),72.2(C-4),78.6(C-5),63.1(C-6),52.0(CH3O)。經(jīng)文獻(xiàn)對(duì)照[16]，鑒定11為京尼平苷。

化合物12：淺黃膠狀固體(甲醇)，ESIMSm/z:469 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD) δ:7.64(1H,s,H-3),6.02(1H,brs,H-7),5.05(1H,d,J=7.0 Hz,H-1),4.95,4.76(1H×2,d,J=14.6 Hz,H-10a,b),4.80(1H,m,H-6),4.71(1H,d,J=8.0 Hz,H-1),3.92(1H,dd,J=11.9,2.1 Hz,H-6a),3.67(1H,dd,J=11.9,6.4 Hz,H-6b),3.35(1H,m,H-3),3.34(1H,m,H-4),3.29(1H,t,J=9.5,8.0 Hz,H-5),3.19(1H,t,J=9.4,8.0 Hz,H-2)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD) δ:101.1(C-1),155.1(C-3),107.9(C-4),42.3(C-5),75.2(C-6),130.5(C-7),145.2(C-8),45.5(C-9),66.3(C-10),169.2(C-11),172.2(C-12),100.3(C-1),74.3(C-2),78.2(C-3),71.2(C-4),77.7(C-5),63.2(C-6),52.5(OCH3),20.1(CH3OCO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[17]，故鑒定化合物12為aitchisonide A。

化合物13：淺黃固體(甲醇)，ESIMSm/z:267 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.06(1H,dd,J=15.8,0.8 Hz,H-7),5.78(1H,dd,J=15.8,6.2 Hz,H-8),4.34(1H,m,H-9),4.05(1H,m,H-3),1.76(2H,m,H2-4),1.65(1H,dd,J=12.3,2.6 Hz,H-2ax),1.44(1H,t,J=12.1 Hz,H-2eq),1.29(3H,d,J=6.5 Hz,H3-10),1.20(3H,s,H3-11),1.13(3H,s,H3-13),0.84(3H,s,H3-12)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:41.0(C-1),46.6(C-2),65.9(C-3),45.8(C-4),78.1(C-5),79.4(C-6),131.3(C-7),136.1(C-8),69.7(C-9),24.3(C-10),27.2(C-11),26.4(C-12),27.5(C-13)。與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照后[18]，鑒定13為3S,5R,6R,9S-tetrahydroxy-7E-megastigmene。

化合物14：淺黃色固體(甲醇)，ESIMSm/z:409 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz,CD3OD)δ:5.87(1H,d,J=1.5 Hz,H-4),5.86(2H,m,H-7,8),4.42(1H,m,H-9),4.34(1H,d,J=8.0 Hz,H-1),3.97(1H,dd,J=12.0,2.5 Hz,H-6a),3.67(1H,dd,J=12.0,5.5 Hz,H-6b),3.36(1H,t,J=9.0 Hz,H-3),3.25(1H,t,J=9.0 Hz,H-4),3.22(1H,m,H-5),3.17(1H,dd,J= 9.0,8.0 Hz,H-2),2.52,2.15(1H×2,d,J=17.0 Hz,H-2a,2b),1.92(3H,d,J=1.5 Hz,H3-13),1.29(3H,d,J=6.5 Hz,H3-10),1.04(3H,s,H3-12),1.03(3H,s,H3-11)；13C-NMR(125 MHz,CD3OD)δ:43.1(C-1),50.8(C-2),201.6(C-3),127.3(C-4),168.2(C-5),80.1(C-6),131.6(C-7),135.6(C-8),77.3(C-9),23.8,24.7(1-CH3×2),21.8(9-CH3),102.8(C-1),75.3(C-2),78.2(C-3),71.7(C-4),78.1(C-5),62.9(C-6)。經(jīng)文獻(xiàn)對(duì)照[19]，鑒定14為(6S,9R)-roseoside。

2.3 黃毛耳草中車葉草苷和京尼平苷的含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 取車葉草苷對(duì)照品和京尼平苷對(duì)照品，分別用甲醇配制得車葉草苷1.28 mg·mL-1和京尼平苷1.50 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，進(jìn)一步用50%甲醇稀釋得含車葉草苷128.00 μg·mL-1和京尼平苷30.00 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取黃毛耳草粉末(過50目篩)約0.50 g，置50 mL錐形瓶中，加50%甲醇25 mL，超聲功率500 W，頻率40 kHz，提取30 min，冷卻；補(bǔ)足減失重，搖勻，濾過，得供試品溶液。

2.3.3 色譜條件 色譜柱：Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)(13∶87)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長：240 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。該色譜條件下，供試品中待測(cè)峰分離良好，見圖2。

圖2 供試品(A)和對(duì)照品(B)HPLC-DAD色譜圖

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取車葉草苷和京尼平苷對(duì)照品，配制得到車葉草苷濃度分別為6.40、12.80、25.60、76.80、102.40、128.00 μg·mL-1，京尼平苷濃度分別為1.50、3.00、6.00、18.00、24.00、30.00 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別以車葉草苷對(duì)照品濃度、京尼平苷對(duì)照品濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得車葉草苷和京尼平苷回歸方程分別為Y1=7.94X-3.59(r=0.999 0)和Y2=15.97X+0.29(r=0.999 3)。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)6針，得車葉草苷、京尼平苷峰面積的RSD分別為0.75%、2.44%，表明本儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取“2.3.2”項(xiàng)下制備所得的供試品溶液，分別于0、2、6、9、12、24 h，精密吸取10 μL，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算各色譜峰面積的RSD，結(jié)果車葉草苷、京尼平苷峰面積的RSD分別為1.11%、2.62%，表明供試品溶液中車葉草苷和京尼平苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3.2”項(xiàng)下，取同批次黃毛耳草，按照供試品制備方法平行制備6份，并按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得車葉草苷、京尼平苷含量均值分別為2.26、0.32 mg·g-1，含量的RSD分別為1.48%、2.34%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)同批次黃毛耳草，精密稱取0.25 g，平行9份，分別加入相當(dāng)于樣品中車葉草苷、京尼平苷含量的50%、100%及150%的車葉草苷對(duì)照品和京尼平苷對(duì)照品，按“2.3.2”項(xiàng)制備樣品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率及RSD。結(jié)果表明，車葉草苷、京尼平苷的平均加樣回收率分別為103.19%、95.06%，RSD分別為2.35%、3.93%，回收率良好，見表2所示。

表2 車葉草苷和京尼平苷的加樣回收率

2.3.9 樣品含量測(cè)定 分別精密稱取不同批次黃毛耳草提取物，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定各樣品中車葉草苷、京尼平苷含量分別為0.733～2.282以及0.080～0.328 mg·g-1，結(jié)果見表3。

表3 10批樣品中車葉草苷成分、京尼平苷成分的含量(n=3)

3 討論

本次從該植物中共分離得到14個(gè)化合物(包括5個(gè)甾體、3個(gè)三萜、4個(gè)環(huán)烯醚萜、2個(gè)降碳倍半萜)，分別鑒定為(24R)-stigmastane-3β,5α,6β-triol(1)、24ξ-ethylcholest-22E-ene-3β,5α,6β-triol(2)、5-stigmasten-3β,7β-diol(3)、豆甾醇(4)、β-谷甾醇(5)、hyptatic acid B(6)、6β-hydroxyursolic acid(7)、齊墩果酸(8)、車葉草苷(9)、車葉草苷酸(10)、京尼平苷(11)、aitchisonide A(12)、3S,5R,6R,9S-tetrahydroxy-7E-megastigmene(13)及(6S,9R)-roseoside(14)，首次基于2D-NMR數(shù)據(jù)對(duì)化合物6的氫譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了完整歸屬。

根據(jù)黃毛耳草化學(xué)成分相關(guān)文獻(xiàn)及本次分離工作結(jié)果，化合物含量比較高的成分且結(jié)構(gòu)類型相對(duì)豐富的為環(huán)烯醚萜苷類(除了本次分離得到的4個(gè)外，還有車葉草苷、去乙酰車葉草苷、6′-乙酰車葉草苷、6′-乙酰去乙酰車葉草苷、車葉草酸、去乙酰車葉草酸、雞屎藤苷甲酯、馬錢子、乙酰雞屎藤苷甲酯、耳草苷、車葉草酸乙酯，6β-羥基京尼平[5]，其次為三萜類。其中，環(huán)烯醚萜苷類化合物具有廣泛的藥理活性。如：車葉草苷(9)和車葉草酸(10)均能通過抑制NF-κB/MAPK信號(hào)通路[20-21]有效減少炎性介質(zhì)產(chǎn)生，京尼平苷(11)具有抗炎、抗病毒[22]等作用。

此外，黃毛耳草為腸炎寧片、傷濕丸等中成藥的主要藥味，其工藝為水提取。而環(huán)烯醚萜苷類成分具有較好的水溶性，因此環(huán)烯醚萜苷類化合物很有可能是黃毛耳草傳統(tǒng)功效“清熱除濕，解毒消腫，活血舒筋”以及現(xiàn)代臨床治療肝炎等多種炎癥的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也可能是黃毛耳草作為中藥成方制劑“腸炎寧”“傷濕丸”“治傷軟膏”中藥效貢獻(xiàn)成分之一。

關(guān)于黃毛耳草的質(zhì)量控制，李晶等[23]以高效液相色譜法，采用雞屎藤苷甲酯為指標(biāo)對(duì)采自江西、福建、浙江和廣西等不同產(chǎn)地的黃毛耳草中含量進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)萍等[24]建立了黃毛耳草的薄層色譜法，分別檢測(cè)了黃毛耳草中環(huán)烯醚萜類(雞屎藤苷甲酯)、黃酮類和內(nèi)酯類成分。另外也有學(xué)者開展了槲皮素和三萜類烏蘇酸的含量測(cè)定[5]，但是到目前為止，對(duì)黃毛耳草環(huán)烯醚萜苷的質(zhì)控相對(duì)薄弱。

本試驗(yàn)選擇本次分離過程中量最大的兩個(gè)成分(均為環(huán)烯醚萜苷)，即車葉草苷和京尼平苷作為對(duì)照品，對(duì)10個(gè)批次市售的黃毛耳草進(jìn)行含量測(cè)定分析，通過比較以下色譜體系：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.1%甲酸溶液，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%甲酸溶液(13∶87)等度洗脫，車葉草苷和京尼平苷可以基線分離，并且兩個(gè)成分均在240 nm下有最大吸收波長，故選擇240 nm作為檢測(cè)波長，經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)車葉草苷以及京尼平苷的含量范圍分別為0.733～2.282和0.080～0.328 mg·g-1，提示環(huán)烯醚萜苷類成分車葉草苷、京尼平苷也可以作為黃毛耳草環(huán)烯醚萜苷類質(zhì)量控制的Q-marker成分。