趙軍 董重陽 師建平 劉晉 黨贏 常虹 海日 李婧

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院；江蘇 南京 210023 3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110 4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性增加，易發(fā)骨折為特征的全身性骨病[1]。2001年美國國立衛(wèi)生研究院將OP定義為骨強(qiáng)度下降、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的骨骼系統(tǒng)疾病[2]。OP分原發(fā)性、繼發(fā)性兩類。原發(fā)性O(shè)P臨床常見，包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)(Ⅰ型)、老年OP(Ⅱ型)、特發(fā)性O(shè)P(包括青少年型)。PMOP即Ⅰ型原發(fā)性O(shè)P，以進(jìn)行性骨丟失、骨小梁退行變、骨質(zhì)疏松、骨脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為臨床特征的全身疾病，具有發(fā)病率隨絕經(jīng)年限延長(zhǎng)而增高特點(diǎn)[3]。本病常見多發(fā)于絕經(jīng)后(自然絕經(jīng)、手術(shù)絕經(jīng))婦女，主因絕經(jīng)后卵巢功能衰竭。卵巢功能衰竭，雌激素水平下降，骨鈣素分泌減少，破骨細(xì)胞作用增強(qiáng)致骨吸收加快；雌激素水平下降抑制甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)分泌，繼發(fā)甲亢，腎維生素D失活，從而使1，25(OH)2D3生成減少，腸吸收鈣功能下降，骨礦攝入量不足終致骨合成減少[4]。PMOP骨吸收與骨形成均加快，按骨重建異常病理分類，PMOP屬高轉(zhuǎn)換型[5]。

蒙醫(yī)典籍《觀者之喜》“老年人赫依偏盛，易骨枯，治以補(bǔ)為主，補(bǔ)暖補(bǔ)精，而抑赫依過剩……”。老年人屬“體熱趨于減弱，顯示赫依優(yōu)勢(shì)”體質(zhì)[6]，此時(shí)體內(nèi)“赫依”體素過剩，使體內(nèi)“三根、七素”平衡失調(diào)，分解、吸收、排泄功能紊亂，精華、糟粕分解不充，骨精減少，發(fā)生骨枯癥[7]，骨脆性增加易骨折。蒙藥藍(lán)刺頭(Echinops sphaerocephalus L.)味苦，性涼，效稀、柔、鈍、輕，有固骨質(zhì)、接骨愈傷、清熱解毒，殺“粘”止痛等效，治筋骨折傷、骨傷熱、刺痛、金創(chuàng)、瘡瘍等[8]。研究顯示[9-12]，蒙藥藍(lán)刺頭可通過雌激素樣作用促骨形成，調(diào)節(jié)骨吸收/骨形成偶聯(lián)，降低骨轉(zhuǎn)換率，達(dá)防治PMOP的目的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1造模動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)藥物：造模動(dòng)物選擇6月齡SD系SPF級(jí)雌性大鼠84只，購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證：SYXK(蒙)2015-0001。蒙藥藍(lán)刺頭原藥購于內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。輔酶Q10片(Co-Q10)[Eisai衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，10 mg/片]。淫羊藿(Herba Epimedii)顆粒購于國醫(yī)堂，北京康仁堂藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：13005361。

1.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備與器材：1/1000電子稱(生產(chǎn)廠家：凱豐集團(tuán)有限公司；型號(hào)：JA503)；微型電子稱(生產(chǎn)廠家：長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司；型號(hào)：ES-600S)；電子天平(生產(chǎn)廠家：上海?？惦娮觾x器廠；型號(hào)：ACS-H1型電子計(jì)重稱)；Micro-CT(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院PET-CT室)。4%甲醛液等由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。造模及取材相關(guān)手術(shù)器械等耗材。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組、建立模型：按隨機(jī)原則將大鼠分7組，每組12只，假手術(shù)組(Sham)、去卵巢骨質(zhì)疏松模型組(OVX)、蒙藥藍(lán)刺頭高劑量組(Echinops-H)、中劑量組(Echinops-M)、低劑量組(Echinops-L)、中藥對(duì)照組淫羊藿組(HEP)、西藥對(duì)照組輔酶Q10組(Co-Q10)。大鼠卵巢摘除法(去勢(shì))制備PMOP大鼠模型[13]。

1.2.2造模是否成功判定：陰道上皮脫落細(xì)胞角化實(shí)驗(yàn)[14]；去卵巢術(shù)后5 d，所有大鼠連續(xù)5 d行陰道上皮脫落細(xì)胞角化實(shí)驗(yàn)，對(duì)比觀察動(dòng)情周期，1次/d。消毒棉簽于大鼠陰道轉(zhuǎn)動(dòng)取脫落細(xì)胞-單向涂抹載玻片轉(zhuǎn)移細(xì)胞-36%甲醛溶液固定15 min-20%甲基藍(lán)染液中染色45 min-蒸餾水沖片-封片-光學(xué)顯微鏡觀察-攝片(見圖1)。

圖1 不同時(shí)期大鼠陰道光鏡下圖片(×400) A：動(dòng)情期；B：動(dòng)情間期Fig.1 Light microscopic images of rat vagina at different stages (×400). A: Estrous period; B: Estrous interval

1.3 給藥方法

造模后飼養(yǎng)90 d后給藥干預(yù)。劑量均據(jù)人鼠體重比例、人鼠代謝速率比折算：蒙藥藍(lán)刺頭高、中、低劑量組給藥劑量為：13、6.5、3.25 mg/mL。低劑量組為臨床等效劑量，高、中、低劑量比例為4∶2∶1。中藥對(duì)照組淫羊藿給藥劑量、西藥對(duì)照組輔酶Q10[15-16]均按成人劑量有效量，23.4375、0.0 313 mg/mL。模型組、假手術(shù)組給藥量以相同計(jì)算方式予生理鹽水。每日稱重記錄，觀察生命情況。

1.4 標(biāo)本采集、指標(biāo)檢測(cè)

處死取右側(cè)完整股骨，分裝于取樣杯4%多聚甲醒固定，采用骨密度(bone mineral density，BMD)儀離體骨(股骨近端BMD和股骨總BMD)BMD測(cè)定、Micro-CT離體骨定量參數(shù)分析、骨微結(jié)構(gòu)三維重建、微觀形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理PH

2 結(jié)果

2.1 骨密度測(cè)定

(1)與假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨近端BMD和全段BMD均明顯降低(P<0.05)，股骨全段BMD下降37.13%(P<0.05)，股骨近端下降23.42%。(2)與模型組比較，蒙藥藍(lán)刺頭高、中、低劑量組、淫羊藿組、輔酶Q10組、假手術(shù)組股骨全段、近端BMD均明顯增高(P<0.05)。(3)與蒙藥藍(lán)刺頭高、中、低劑量組比較，BMD計(jì)量結(jié)果西藥對(duì)照組輔酶Q10組優(yōu)于蒙藥藍(lán)刺頭高、低劑量組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；西藥對(duì)照組輔酶Q10組與蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組比，二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。BMD計(jì)量結(jié)果淫羊藿組優(yōu)于蒙藥藍(lán)刺頭高、低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；淫羊藿組與蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組比，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(4)淫羊藿組與輔酶Q10組比較，BMD計(jì)量淫羊藿組略占優(yōu)勢(shì)，但二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 骨形態(tài)學(xué)計(jì)量(Micro-CT)骨微結(jié)構(gòu)測(cè)定

Micro-CT掃描三維重建測(cè)定各組大鼠右側(cè)股骨組織體積(bone volume，BV)、骨小梁體積分?jǐn)?shù)(bone volume/tissue volume，BV/TV)(%)、骨小梁體積與興趣區(qū)間體積的比值(BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)(mm)、骨小梁寬度(trabecular widthness，Tb.Wi)(mm)、骨小梁分離度(trabecular spacing，Tb.Sp)(mm)、骨小梁數(shù)目(trabecular number，Tb.N)(mm-1)、骨小梁模塊因素(trabecular pattern factor，Tb.Pf) (mm-1)值。(1)與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨微結(jié)構(gòu)骨小梁立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)異常，骨微結(jié)構(gòu)形態(tài)計(jì)量學(xué)各參數(shù)值BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.Wi、Tb.N均明顯降低(P<0.05)；Tb.Sp、Tb.Pf增大(P<0.05)。骨小梁體積密度下降50.0%(P<0.05)。(2)與模型組比較，蒙藥藍(lán)刺頭高、中、低劑量組、淫羊藿組、輔酶Q10組、假手術(shù)組骨微結(jié)構(gòu)骨小梁立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯改善(P<0.05)。蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組、淫羊藿組、輔酶Q10組大鼠BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N明顯上升(P<0.05)，Tb.Sp、Tb.Pf明顯減少(P<0.05)。(3)與蒙藥藍(lán)刺頭高、中、低劑量組比較，骨形態(tài)學(xué)計(jì)量測(cè)定結(jié)果輔酶Q10組優(yōu)于蒙藥藍(lán)刺頭高、低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；輔酶Q10組與蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組比較，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。骨形態(tài)學(xué)計(jì)量測(cè)定結(jié)果淫羊藿組優(yōu)于蒙藥藍(lán)刺頭高、低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；淫羊藿組與蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組比，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(4)淫羊藿組與西藥對(duì)照組輔酶Q10組比較，骨形態(tài)學(xué)計(jì)量淫羊藿組略占優(yōu)勢(shì)，但二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2～3，表2。

表1 各組大鼠股骨全段、近端骨密度比較

圖2 股骨全長(zhǎng)冠狀位三維重建骨小梁顯示 A：假手術(shù)組；B：模型組；C：中藥對(duì)照淫羊藿組；D：蒙藥藍(lán)刺頭高劑量組；E：蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組；F：蒙藥藍(lán)刺頭低劑量組；G：西藥對(duì)照輔酶Q10組Fig.2 Three-dimensional reconstruction of the femoral trabecula in full-length coronal position. A: Sham operation group (Sham); B: Model group (OVX); C: Traditional Chinese medicine control group (HEP); D: Mongolian medicine high dose group (echinops-h); E: Mongolian medicine medium dose group (echinops-m); F: Mongolian medicine low dose group (echinops-l); G: Western medicine irradiation coenzyme Q10 group (CoQ10).

圖3 股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨感興趣區(qū)域定位 A：假手術(shù)組；B：模型組；C：中藥對(duì)照淫羊藿組；D：蒙藥藍(lán)刺頭高劑量組；E：蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組；F：蒙藥藍(lán)刺頭低劑量組；G：西藥對(duì)照輔酶Q10組Fig.3 Location of region of interest in cancellous bone of the distal femur. A: Sham operation group (Sham); B: Model group (OVX); C: Traditional Chinese medicine control group (HEP); D: Mongolian medicine high dose group (echinops-h); E: Mongolian medicine medium dose group (echinops-m); F: Mongolian medicine low dose group (echinops-l); G: Western medicine irradiation coenzyme Q10 group (CoQ10).

表2 各組大鼠股骨干干骺端松質(zhì)骨Micro-CT微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 2 Microstructure parameters of the cancellous bone in the metaphyseal femur of rats in each

3 討論

3.1 大鼠骨密度結(jié)果分析

OP由增齡、其他復(fù)雜因素引起全身性代謝性骨病，病理損害以骨退行性、微結(jié)構(gòu)改變、單位骨量下降致骨脆性、易發(fā)骨折特征。BMD值測(cè)量仍是目前OP診斷的首選方式，也是預(yù)測(cè)骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有效指標(biāo)[17]。骨強(qiáng)度75%～80%由骨量決定，雙能X線吸收法測(cè)定骨密度值是判定防治OP藥物療效的金標(biāo)準(zhǔn)[18]。近年OP研究深入，Micro -CT、PET-CT掃描已被廣泛應(yīng)用于OP。Micro-CT可通過目標(biāo)骨骼掃描重建，除可擬和計(jì)算BMD值，具有測(cè)量骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)、骨微結(jié)構(gòu)觀察等優(yōu)勢(shì)。本研究顯示大鼠去卵巢術(shù)后骨量加速丟失，BMD降低，骨微結(jié)構(gòu)退變，呈OP樣骨質(zhì)特征。傳統(tǒng)醫(yī)藥可有效抑制絕經(jīng)后骨骼骨吸收參數(shù)，增加BMD、全身骨礦含量[19]。去卵巢OP模鼠股骨兩端主要結(jié)構(gòu)為松質(zhì)骨，中間段股骨由皮質(zhì)骨構(gòu)成，而松質(zhì)骨骨小梁占表面積大，松質(zhì)骨表面骨轉(zhuǎn)換比皮質(zhì)骨高多倍[20]。本研究用雙能X線吸收法測(cè)假手術(shù)組、模型組大鼠BMD。結(jié)果顯示去卵巢術(shù)后各組大鼠BMD下降明顯，表現(xiàn)為松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨骨量相繼減少，皮質(zhì)骨變薄，BMD下降；適當(dāng)劑量蒙藥藍(lán)刺頭具有明顯抗PMOP作用。

3.2 大鼠骨形態(tài)學(xué)計(jì)量骨微結(jié)構(gòu)(Micro-CT)結(jié)果分析

骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)是對(duì)骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)行定量分析的最佳方式。本研究用Micro-CT對(duì)大鼠右側(cè)離體股骨全段掃描，操作平臺(tái)行全股骨三維重建，設(shè)定興趣區(qū)域?qū)墙M織形態(tài)學(xué)具有代表性指標(biāo)行測(cè)定分析。主要觀察BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.Wi、Tb.Sp、Tb.N、Tb.Pf等指標(biāo)變化。BV減小說明骨組織OP樣改變?cè)矫黠@；BV/TV與OP樣改變程度成正比；Tb.Th、Tb.Wi值越小說明OP樣骨質(zhì)改變?cè)矫黠@；OP骨組織見骨小梁排列稀疏、髓腔增大，Tb.Sp值增大；Tb.N越少，OP樣改變?cè)矫黠@；Tb.Pf與骨組織OP樣改變呈正相關(guān)。結(jié)果顯示去卵巢術(shù)后各組大鼠骨組織體積、骨小梁體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁寬度、骨小梁數(shù)目、骨小梁模塊因素下降明顯，骨小梁分離度升高明顯；適當(dāng)劑量蒙藥藍(lán)刺頭可明顯提高大鼠骨組織體積、骨小梁體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁寬度、骨小梁數(shù)目、骨小梁模塊因素，明顯降低骨小梁分離度，具明顯抗PMOP作用。

綜上所述，本研究從去卵巢PMOP模型大鼠藥物干預(yù)后骨微結(jié)構(gòu)變化，直觀證實(shí)蒙藥藍(lán)刺頭具較強(qiáng)固骨質(zhì)作用，說明其增強(qiáng)成骨分化、骨形成力，降低骨代謝轉(zhuǎn)換水平，減少骨吸收。研究結(jié)果為蒙醫(yī)藥補(bǔ)暖補(bǔ)精-清鎮(zhèn)赫依-固骨質(zhì)壯骨治法經(jīng)典抗OP理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為本病臨床防治、衰老相關(guān)疾病研究提供新思路，為更深入闡釋蒙醫(yī)“補(bǔ)腎氣(赫)-清鎮(zhèn)赫依-固骨質(zhì)壯骨”理論科學(xué)內(nèi)涵提供思路借鑒。