黃 杰，楊會肖，廖煥琴，張衛(wèi)華，徐 放，潘 文，楊曉慧

(廣東省森林培育與保護利用重點實驗室/廣東省林業(yè)科學研究院，廣東 廣州 510520)

在世界范圍內(nèi)，非生物脅迫是制約植物生長的重要因素。隨著世界優(yōu)質(zhì)土地資源的減少及氣候的變化，植物的生存環(huán)境更加惡劣。在野外，非生物脅迫對植物的影響是普遍的，且這些脅迫很少單獨出現(xiàn)，植物通常會同時受到幾種非生物因素的綜合脅迫，而且很多脅迫對植物是致命的[1-4]。在此背景下，了解植物的抗逆性和逆境適應機制非常重要，有利于制定合理高效的植物栽培管理方案。

桉樹Eucalyptus是桃金娘科桉樹屬植物，原產(chǎn)澳洲，因為速生性和強適生性成為世界上公認的三大造林樹種之一，是我國華南地區(qū)重要的紙漿材造林樹種，也是我國南方地區(qū)重要的造林樹種，具有良好的經(jīng)濟效益和生態(tài)價值。為了更好地了解這一重要樹種的聯(lián)合抗逆機制，我們研究了尾葉桉Eucalyptus urophylla在水分和養(yǎng)分單獨和組合脅迫下的轉錄響應。

當前國內(nèi)外對植物應對非生物脅迫有諸多研究，但主要集中在單因素脅迫上，對綜合脅迫研究較少[1]。與單獨脅迫相比，植物對綜合脅迫的響應具有特異性，有研究表明擬南芥和煙草對干旱和熱的聯(lián)合脅迫的響應是獨特的，這種綜合脅迫下確立的基因和功能途徑可能為植物應對逆境脅迫提供新思路[5-7]。前期綜合脅迫研究的材料多集中于一些模式植物，如擬南芥[7]、玉米[8]、高粱[9]等草本植物，對長生長周期的木本植物鮮有報道[10]。木本植物的優(yōu)良生物學特性及豐富的遺傳特征不能被模式植物解釋和代表[10]；所以，加強非模式木本植物抗性的分子生物學研究不僅對加深植物抗性機理理解、豐富優(yōu)良遺傳基因資源具有重要的意義，也是我國林木育種研究的新方向。綜上所述，本研究基于分子生物學研究手段，對尾葉桉開展組合逆境響應防御的分子生物學機制研究具有重要的現(xiàn)實意義和理論價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、脅迫處理和樣品采集

基于廣東省林業(yè)科學研究院木本花卉與竹子研究團隊前期尾葉桉水肥精準測定試驗結果，選取在各個處理中均表現(xiàn)較好的尾葉桉無性系ZQUA44為試驗材料。2015年3月，將長勢基本一致、狀態(tài)良好的3月生尾葉桉幼苗種植于黑色定植袋中，以黃心土為基本栽培基質(zhì)，通過施加不同量的基肥及追肥控制養(yǎng)分含量；以黑白膜覆蓋定植袋口控制外界水分進入，通過定量澆水控制水分含量。養(yǎng)分和水分各自設置2個處理，分別為處理和對照。養(yǎng)分處理包括缺養(yǎng)[基肥：鈣鎂磷肥(Calcium magnesium phosphate fertilizer, CMPF)250 g]和對照 (基肥：CMPF 250 g+復合肥 150 g)，水分處理包括缺水(2 0%～4 0%田間持水量)和對照(60%～80%田間持水量)[11]。試驗采用兩因素兩水平正交試驗，每個處理重復3次，培養(yǎng)周期18個月。于2015年3月在自然條件下控制材料水分、養(yǎng)分進行試驗。各處理如下所示。水肥雙因素脅迫：20%～40% 田間持水量，基肥為 CMPF 250 g；水分單因素脅迫：20%～40%田間持水量，基肥為CMPF 250 g+復合肥 150 g；養(yǎng)分單因素脅迫：60%～80% 田間持水量，基肥為 CMPF 250 g；CK：60%～80% 田間持水量，基肥為 CMPF 250 g+復合肥 150 g。水分單因素脅迫和對照處理在種植2個月后施尿素100 g，8月份施復合肥150 g，第2年春天施復合肥100 g。樣本處理周期較長，試驗過程中要一直模擬野外不利環(huán)境條件，確保樣本長期處于脅迫中。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長指標測定 對4種處理下生長18個月的植物樣本進行生長指標測定。采用測量桿測定樹高、冠長等指標，采用游標卡尺測定地徑。收集4種處理下的植物樣本測定生物量，采用托盤天平測量新鮮樣本的葉片、主干、側枝和根的鮮質(zhì)量；將所有樣本組織放入75 ℃烘箱48 h后，測量各處理葉片、主干、側枝和根的干質(zhì)量。

1.2.2 RNA 提取、轉錄組測序及數(shù)據(jù)分析 采集4種處理下尾葉桉葉片組織樣本，采用RNAprep pure Plant Kit試劑盒 (Qiagen China，上海)進行總RNA提取和純化。利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，采用納米分光光度計檢測RNA純度和含量。每個樣品取3 μg高質(zhì)量RNA進行cDNA文庫構建，然后采用Illumina Hiseq測序平臺進行雙末端測序。整個測序流程包括文庫構建、測序、數(shù)據(jù)預處理，全面委托諾禾致源生物技術有限公司完成。以巨桉Eucalyptus grandis基因組為參考基因組，采用TopHat v2.0.9軟件將高質(zhì)量clean reads比對到參考基因組上，后經(jīng)Scripture(beta2)和Cufflinks(v2.1.1)組裝獲得轉錄本全長。各個基因的表達量采用Cuffdiff(v2.1.1)軟件計算獲得，將Q<0.05的基因定義為差異表達基因。

1.2.3 差異表達基因驗證 為了驗證轉錄組測序得到的表達數(shù)據(jù)，隨機選取4個具有不同表達模式的差異表達基因進行逆轉錄實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證。采用 FastKing RT Kit [(天根生化科技(北京)有限公司)]合成cDNA。采用NCBI Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer/blast/index.cgi?LINK_LOC)設計特異性引物 (表 1)。以 18s rRNA 為內(nèi)參，采用 FastKing RT Kit在 7500 Real-time PCR 儀器中進行 qRT-PCR，每個基因重復3次。使用R(版本3.1.3，http://cran.rproject.org/)軟件對4種處理下qRT-PCR數(shù)據(jù)和轉錄組測序數(shù)據(jù)進行相關性分析。

表1 qRT-PCR驗證的引物信息Table 1 Primers for qRT-PCR validation

1.2.4 功能注釋、GO 和 KEGG 分類 以巨桉(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!bulk?o rg=Org_Egrandis)和TAIR(https://www.arabidopsis.org/)數(shù)據(jù)庫對每個差異表達基因進行功能注釋。在3種脅迫處理中，以擬南芥為背景(FDR < 0.05)，通過AgriGO(http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php)對每個處理的上、下調(diào)差異表達基因進行GO分類，同時通過KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php，P< 0.01)對差異表達基因進行KEGG通路分析。

2 結果與分析

2.1 不同水肥單、雙因素脅迫影響樹木生長

為了研究水肥單、雙因素脅迫對尾葉桉ZQUA44的影響，我們在處理后18個月測量了參試基因型的生長性狀。結果表明，與對照相比，不同處理條件下尾葉桉的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和冠長等生長指標均受到不同程度的抑制(圖1)。其中，水肥雙因素脅迫的總生物量(鮮質(zhì)量547.30 g，干質(zhì)量197.76 g)低于水分單因素脅迫 (鮮質(zhì)量 2 355.14 g，干質(zhì)量 1 562.78 g)(P<0.05)和養(yǎng)分單因素脅迫 (鮮質(zhì)量 985.72 g，干質(zhì)量 395.61 g)(P>0.05)(圖 1A)；在地下部分生物量、樹高、地徑、冠長等指標中出現(xiàn)了同樣的規(guī)律 (圖 1B、1D、1E、1F)，說明雙因素綜合脅迫對植物生長性狀的影響遠大于單因素脅迫，且差異顯著。養(yǎng)分單因素脅迫的根冠比(0.594)與水肥雙因素脅迫(0.582)差異不明顯，但顯著大于水分單因素脅迫(0.302)和對照(0.296)(圖1C)。結果表明，在不同脅迫處理條件下植物地上、地下部分受到的影響不完全相同。

圖1 4種不同水肥處理中尾葉桉無性系生長指標的變化Fig.1 Growth index changes ofEucalyptus urophylla clones in four different water and fertilizer treatments

2.2 轉錄組測序和差異表達基因篩選

由表2可知，水肥雙因素脅迫、水分單因素脅迫和養(yǎng)分單因素脅迫轉錄組測序各獲得3.01×108、2.69×108和 2.74×108條 clean reads；Q20、Q30 均在88.20%以上，堿基測序錯誤率≤0.02%，測序質(zhì)量較高，確保了測序結果的可靠性。3種脅迫處理下共獲得5 547 個差異表達基因，其中 2 082 個上調(diào)，3 465個下調(diào)，下調(diào)數(shù)量多于上調(diào)，說明在外界環(huán)境的非生物脅迫下，植物的生命活動受到一定程度的抑制；水肥雙因素脅迫的差異表達基因數(shù)量遠高于水分單因素脅迫和養(yǎng)分單因素脅迫，說明雙因素脅迫條件下植物生命活動受到的抑制作用高于單因素脅迫(圖2)。

圖2 3種脅迫處理中尾葉桉差異表達基因分布情況Fig.2 Distribution of differentially expressed genes of Eucalyptus urophylla in three stress treatments

與對照相比，將不同脅迫下的差異表達基因進行比較(圖3)發(fā)現(xiàn)，水肥雙因素脅迫、水分單因素脅迫和養(yǎng)分單因素脅迫分別有1 195、222、665 個上調(diào)基因，1 390、1 250、825 個下調(diào)基因。上調(diào)的差異表達基因中，水肥雙因素脅迫有761個基因具有表達特異性，遠高于水分單因素脅迫(208個)和養(yǎng)分單因素脅迫(222個)。有12個差異表達基因在水分單因素脅迫和養(yǎng)分單因素脅迫中共同表達，3個在水分單因素脅迫和水肥雙因素脅迫中共同表達，432個在水肥雙因素脅迫和養(yǎng)分單因素脅迫中共同表達，3種脅迫處理僅有1個相同的上調(diào)基因。下調(diào)的差異表達基因中，水肥雙因素脅迫、水分單因素脅迫、養(yǎng)分單因素脅迫處理的特異性差異表達基因分別有720、1 165和174個。此外，有54個基因在水分單因素脅迫和養(yǎng)分單因素脅迫中共同表達，73個在水肥雙因素脅迫和水分單因素脅迫中共同表達，639個在水肥雙因素脅迫和養(yǎng)分單因素脅迫中共同表達，42個在3種脅迫處理中共同表達。3種脅迫處理分別獲得155、75和108個基因編碼轉錄因子。

表2 3種脅迫處理中尾葉桉葉片轉錄組測序質(zhì)量1)Table 2 Transcriptome sequencing quality ofEucalyptus urophylla leaves in three stress treatments

圖3 3種脅迫處理中尾葉桉差異表達基因韋恩圖Fig.3 Venn diagram of differentially expressed genes ofEucalyptus urophylla in three stress treatments

2.3 差異表達基因的GO和KEGG分析

為了研究不同處理條件下差異表達基因的生物學功能，對差異表達基因進行GO和KEGG分類。GO分類結果(圖4)顯示，水肥雙因素脅迫的差異表達基因顯著富集于35個類別中，分別為生物過程中的類黃酮代謝過程、跨膜轉運蛋白活性等，分子功能中的轉移酶活性、催化活性等；水分單因素脅迫的差異表達基因顯著富集于42個GO分類中，包括生物過程中的苯丙烷代謝過程、細胞表面受體信號通路，分子功能中的催化活性、氧化還原酶活性等；養(yǎng)分單因素脅迫的差異表達基因顯著富集在50個GO類別中，在生物過程中顯著富集于運輸活性、類黃酮代謝過程等，在分子功能中顯著富集于運輸活性、轉移酶活性等。

圖4 3種脅迫處理中尾葉桉差異表達基因的GO分類Fig.4 GO categories of differentially expressed genes ofEucalyptus urophylla in three stress treatments

KEGG通路顯著性富集分析結果(圖5)顯示，水肥雙因素脅迫的差異表達基因主要富集在苯丙烷生物合成、糖酵解/糖異生等13個途徑中 (P< 0.000 01，Q< 0.01)；水分單因素脅迫的差異表達基因主要富集在苯丙烷生物合成、DNA復制等5個途徑中；養(yǎng)分單因素脅迫的差異表達基因主要富集在苯丙烷生物合成、抗壞血酸和藻酸鹽代謝等16個途徑中。KEGG結果顯示苯丙烷生物合成途徑相關基因廣泛參與植物的抗逆過程。

圖5 3種脅迫處理中尾葉桉差異表達基因的KEGG分析Fig.5 KEGG analyses of differentially expressed genes ofEucalyptus urophylla in three stress treatments

2.4 轉錄組數(shù)據(jù)的qRT-PCR驗證分析

為了驗證轉錄組測序數(shù)據(jù)的可信度，隨機選取4個具有不同表達模式的差異表達基因進行qRTPCR驗證。結果(圖6)顯示：轉錄組測序獲得的數(shù)據(jù)與 qRT-PCR 結果相關性較高，R2= 0.705，說明轉錄組測序結果可靠。

圖6 4個基因的轉錄組測序結果與qRT-PCR驗證結果的相關性分析Fig.6 Correlation analyses between transcriptome profiling and qRT-PCR verification results of four genes

3 結論與討論

3.1 水肥單、雙因素脅迫對尾葉桉生長發(fā)育的影響

植物生長受外界環(huán)境影響，本研究3種脅迫處理下尾葉桉各項生長指標多顯著低于對照，說明3種脅迫處理均在一定程度上抑制植物的生長發(fā)育。水肥雙因素脅迫下尾葉桉總生物量最低，干質(zhì)量 197.76 g，鮮質(zhì)量 547.30 g；其次為養(yǎng)分單因素脅迫，干質(zhì)量 395.61 g，鮮質(zhì)量 985.72 g；生長受到影響最小的是水分單因素脅迫，干質(zhì)量1 562.78 g，鮮質(zhì)量2 355.14 g；說明與單因素脅迫相比，雙因素脅迫對植物生長發(fā)育的影響更大。同時，本研究結果顯示，養(yǎng)分單因素脅迫對植物生長發(fā)育的影響顯著大于水分單因素的影響，說明在土壤水分充足時，養(yǎng)分在尾葉桉的生長發(fā)育過程中起重要作用。在植物生長發(fā)育過程中，地上部分和地下部分的養(yǎng)分分配均受外界環(huán)境影響。不同營養(yǎng)元素或不同營養(yǎng)水平對根冠比的影響也不同。氮素少時，首先確保根的生長，運到冠部的氮素減少，根冠比變大。磷、鉀肥可以調(diào)節(jié)碳水化合物的轉化和運輸，促進光合產(chǎn)物向根和貯藏器官轉移，增加根冠比[12]。本研究水肥雙因素脅迫的根冠比(0.582)和養(yǎng)分單因素脅迫的根冠比(0.594)均大于對照(0.296)，說明在受到水肥雙因素脅迫和養(yǎng)分單因素脅迫時，尾葉桉可能通過將養(yǎng)分分配給根系促進根部生長、降低地上部分生物量來應對逆境。

本研究結果揭示在3種脅迫處理下尾葉桉的生長發(fā)育變化具有特異性，綜合脅迫對植物生長的影響比單獨脅迫更加復雜，不同脅迫下植物可能具有不同的響應方式。

3.2 轉錄組分析揭示尾葉桉在響應水肥脅迫時差異基因的表達變化

面臨脅迫時，植物改變其生化和分子機制以適應環(huán)境的變化。脅迫信號會被細胞表面的受體感知并啟動相關的信號轉導途徑，轉錄調(diào)控基因的表達，積極對脅迫做出響應。尾葉桉在不同脅迫條件下的響應方式與其內(nèi)在的分子調(diào)控機制密不可分。水肥單、雙因素3種脅迫處理差異表達基因的GO分析顯示尾葉桉在養(yǎng)分單因素脅迫下的功能分類與其他植物[13]類似，差異基因顯著富集于類黃酮代謝過程、苯丙烷代謝過程、脅迫響應細胞信號轉導、細胞增殖和生長調(diào)控等相關途徑。水分單因素脅迫誘導大量離子轉運和跨膜轉運蛋白相關基因的表達改變，這很可能是脅迫破壞了細胞內(nèi)、細胞間以及根際環(huán)境中的離子平衡或引發(fā)細胞膜電位的變化，導致離子重新分配[14-15]。在水肥雙因素脅迫中，除上述代謝途徑外，還包括蠟代謝過程、脫落酸響應途徑、糖代謝途徑等相關基因也發(fā)生差異表達。尾葉桉在水分、養(yǎng)分單因素脅迫下差異表達基因表達模式的相似性，揭示不同脅迫之間可能存在共同的信號轉導及基因表達調(diào)控機制，雙因素脅迫是不盡相同的復雜過程，可能涉及更多的基因和轉錄途徑。

在3種脅迫處理中差異表達基因均富集在類黃酮代謝、苯丙烷代謝途徑，說明不同脅迫之間可能存在共同的信號轉導及基因表達調(diào)控機制。苯丙烷類代謝產(chǎn)物經(jīng)類黃酮途徑產(chǎn)生黃酮類化合物間接參與呼吸代謝，可作為植物體特殊貯能幫助植物體清除自由基等[3]。干旱、高鹽等非生物脅迫會使植物產(chǎn)生大量活性氧，從而誘導合成黃酮類化合物以避免細胞氧化損傷。黃酮類化合物還可以與銅等金屬離子結合，從而降低金屬離子對胞質(zhì)結構的破壞[16]。

3.3 尾葉桉脅迫應答的轉錄因子及調(diào)控機制

轉錄調(diào)控主要通過轉錄因子與相應的順式作用元件相互作用實現(xiàn)[17]。與植物抗逆相關的轉錄因子主要包括 MYB、bZIP、AP2/EREBP、WRKY 和NAC[17-23]等5類。本文通過對3種脅迫處理的轉錄組數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)以上述轉錄因子為主的多種不同家族的轉錄因子在受脅迫后均差異表達，它們可以通過調(diào)控應答基因、植物抗逆信號通路基因和自身基因的表達來啟動植物對非生物脅迫的適應機制。這幾類轉錄因子的大量表達說明它們在尾葉桉應對水肥單、雙因素脅迫的多種不同應答途徑中起著十分重要的作用。

除此之外，我們在水肥雙因素脅迫處理下差異表達的轉錄因子中還發(fā)現(xiàn)了一些特有的轉錄家族，WOX轉錄因子家族的WOX4、ARF轉錄因子家族的ARF10以及DBB類鋅指蛋白。WOX蛋白家族是植物特有的一類轉錄因子家族，是植物胚胎建成、干細胞維持和器官發(fā)生等發(fā)育過程中的重要調(diào)控因子。有研究表明，WOX蛋白家族通過相似或特異的調(diào)控網(wǎng)絡參與植物初級和次級分生組織等各級干細胞的維持和分化[24-25]。WOX4為WOX蛋白家族的進化支，GUS染色和原位雜交試驗表明WOX4主要在維管分生組織中表達。植物獨有的WOX蛋白家族對植物體的生長發(fā)育有非常重要的作用，WOX成員通過特化干細胞屬性和維持分生組織動態(tài)平衡來參與植物體發(fā)育的各個過程，這些功能都與它促進細胞分裂和(或)抑制細胞分化密切相關[24-26]。在水肥雙因素脅迫中尾葉桉WOX4基因表達上調(diào)，由此推測在水肥雙因素脅迫條件下WOX4轉錄因子被正向調(diào)控參與初級分生組織和次級分生組織的分化，通過促進細胞分裂和(或)抑制細胞分化來維持分生組織的平衡，從而調(diào)節(jié)尾葉桉生長發(fā)育各個過程；但其具體的轉錄調(diào)控機制尚不清楚，對其轉錄調(diào)控機制的揭示有利于進一步理解在水肥雙因素脅迫中尾葉桉生長發(fā)育過程中的分子調(diào)控機制。