李夢圓, 徐金龍, 劉 詠, 王軍輝

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

花菇是一種大型真菌,素有“山珍”之稱,屬于擔子菌綱(Basidiomycotina),傘菌目(Agaricales),白蘑科(Tricholomataceae)。黃山花菇產自安徽黃山,是黃山的一大特產,是可蔬可藥的山中珍品,其營養(yǎng)豐富,含有多糖、氨基酸、維生素、核酸、甾醇類等多種成分。特別是花菇多糖(floral mushroom polysaccharides,FMPS)有抗瘤、抗癌、降血糖、增強免疫力等功效[1-2]。目前國內外關于FMPS的研究多集中在多糖提取方面,而對其生物活性的研究報道較少[2-4]。本課題組已經(jīng)對黃山花菇多糖的理化性質、流變學性質和抗氧化活性進行了研究,得出其為三螺旋結構,主鏈由(1→3)-β-D-Glcp組成,在主鏈O-6的位置連有支鏈T-β-D-Glcp,溶液為假塑性流體,對于DPPH自由基和羥基自由基有很強的清除能力,具有一定的Fe2+螯合能力和ABTS自由基清除能力[5-6]。有報道證實硫酸基團的加入可以改變多糖的理化性質和鏈構象,而且其抗腫瘤活性有明顯的增強[7]。

本實驗采用氯磺酸-吡啶法對FMPS進行硫酸化修飾,通過正交試驗對修飾條件進行優(yōu)選,并用MTT法測定了硫酸化產物的體外抗腫瘤活性,旨在選出硫酸化修飾的最佳條件和抗腫瘤的最佳質量濃度,為黃山花菇多糖進一步研究和功能性食品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃山花菇干品購自安徽省黃山市,經(jīng)高速藥物粉碎機粉碎后備用;肝癌細胞株(HepG2),購自Hyclone公司;DMEM/High-Glucose培養(yǎng)基,購自Thermo公司;丙酮、石油醚、乙醇、氯仿、正丁醇、硼氫化鈉、氫氧化鈉、氯磺酸、二甲基甲酰胺、吡啶、明膠、氯化鋇、三氯乙酸和無水硫酸鈉等均為分析純(AR),購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

ST-16R 高速冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific公司);W201B 旋轉蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術有限公司);FD-1A-50 冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);Nicolet 67 紅外光譜儀(Thermo公司);SW-CJ-1F超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司);MCO-17AIC CO2培養(yǎng)箱(日本三洋電機株式會社);XD-202 倒置顯微鏡(南京江南永新光學有限公司);Multiskan Go 1510 酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 黃山花菇多糖的提取

稱取150 g花菇粉末,用5 L 0.05% NaBH4/5% NaOH溶液在室溫下提取2 h,2次提取后,合并濾液,用乙酸中和,旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至溶液體積為300 mL,加入4倍體積的95%乙醇醇沉24 h,抽濾得沉淀,將沉淀復溶于蒸餾水,用Seveg試劑(三氯甲烷與正丁醇體積比為5∶1)脫蛋白,Seveg試劑與糖液體積比為1∶5～1∶4,重復操作幾次,直至無明顯蛋白質析出。用分液漏斗除去蛋白質,糖液減壓蒸餾濃縮,去除三氯甲烷。加H2O2脫色3～4 h,透析,冷凍干燥,得黃山花菇多糖FMPS,提取率為4.7%。

1.4 氯磺酸吡啶法進行多糖硫酸化

精確稱取100 mg FMPS,室溫下磁力攪拌溶于10 mL二甲基甲酰胺(DMF)中。在三口瓶中放入25 mL吡啶,加入一定體積的氯磺酸,反應置于冰鹽浴中并不斷攪拌。充分混合后,將溶解于DMF中的多糖加入三口瓶中并移至150 ℃油浴中反應。然后冷卻至室溫,倒入100 mL冰水中,用2.5 mol/L NaOH中和,加入95%乙醇沉淀。離心,取沉淀復溶于水中,用自來水透析2 d,再用去離子水透析1 d,冷凍干燥得黃山花菇硫酸酯化多糖(FMPS-S)[8]。

1.5 正交實驗的因素和水平

據(jù)文獻報道,反應溫度、試劑的配比和反應時間對硫酸化修飾的影響較大[9]。因此選用反應溫度(A)、氯磺酸與吡啶的體積比(B)和反應時間(C)作為因素,每個因素取3個水平,以硫酸基的取代度為指標,選用正交表L9(34)進行正交試驗,見表1所列。

表1 因素水平

1.6 紅外光譜測定

采用溴化鉀壓片法[10],稱取1～2 mg硫酸化前和硫酸化后的多糖樣品,與溴化鉀一起研磨,混合均勻后壓片,在傅里葉紅外光譜儀上測定,掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.7 硫酸酯化多糖硫酸基質量分數(shù)測定

1.7.1 硫酸基標準曲線繪制

精確吸取0.6 mg/mL標準Na2SO4溶液0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mL,以1 mol/L HCl溶液補至0.2 mL。以0.2 mL 1 mol/L的HCl溶液為空白,加入3.8 mL 3%的三氯乙酸和1 mL 5 mg/mL的氯化鋇溶液。搖勻,室溫靜置15 min后于360 nm測吸光度A1;以1 mL 5 mg/mL的明膠溶液代替5 mg/mL BaCl2溶液測吸光度A2。以硫酸基毫克數(shù)為橫坐標,吸光度(A1-A2)為縱坐標,平行做3次,取平均值制作硫酸基質量分數(shù)標準曲線[11-12],得回歸方程為:

y=0.334x-0.023 5,R2=0.998 4。

1.7.2 硫酸基質量分數(shù)測定

分別稱取硫酸化前和硫酸化后樣品30 mg放入50 mL容量瓶,加入10 mL 的1 mol/L HCl溶液中,100 ℃水解3 h,冷卻后加1 mol/L HCl溶液定容至50 mL,過濾除去不溶物。取樣液0.2 mL按照標準曲線制備方法測得吸光度A1、A2。根據(jù)A1-A2的數(shù)值在硫酸基標準曲線中得出樣品硫酸基毫克量并計算硫酸根取代度(DS)：

DS=(1.62wS)/(32-1.02wS)，

其中,wS為多糖中硫元素質量分數(shù)。

1.8 體外抗腫瘤實驗

取90 μL細胞液于96孔板中,細胞密度約為1×105個/mL,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后,加入10 μL不同質量濃度(20、50、100、200、500 μg/mL)的黃山花菇多糖FMPS及硫酸化后的多糖,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,加入20 μL 5 mg/mL的MTT試劑培養(yǎng)4 h,移去上清液,加入200 μL DMSO,振蕩10 min后用酶標儀在570 nm下測定吸光度值。多糖對肝癌細胞的抑制率的計算公式為:

抑制率=[(Abs0-Abs1)/Abs0]×100%,

其中,Abs1、Abs0分別為樣品組和對照組的吸光度值。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Orign 8.0軟件繪制圖表,利用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理,*p<0.05表示差異顯著,**p<0.01表示差異極顯著。

2 結果分析

2.1 正交試驗結果

正交試驗結果見表2所列,FMPS-S2和FMPS-S5比較得出,當試劑比例和時間一定時,溫度上升時硫酸基取代度增加;從FMPS-S5和FMPS-S6得出,溫度和時間不變,吡啶量減少取代度增加;比較FMPS-S6和FMPS-S7,時間不變吡啶的量上升后取代度應該下降,然而試驗結果表明取代度上升,證明溫度上升時取代度上升,且溫度比試劑比例對取代度的影響更大;比較FMPS-S6和FMPS-S9,試劑比例不變,溫度上升取代度應該上升,然而試驗結果是取代度下降,表明時間變短取代度降低,且比溫度對取代度的影響更大。由極差R也可以得出,影響多糖FMPS硫酸酯化取代度DS的因素主次順序為C>A>B,這和推論出的結果一致,但與文獻[13]得出的結論(A>C>B)有差異,這可能由于在高溫下進行多糖硫酸化破壞了多糖的結構,使其降解,而隨著反應時間的增加,反應物充分接觸,反應得以完全發(fā)生,導致硫酸化取代度DS隨之升高,因此高溫下反應時間開始占主導地位。根據(jù)取代度DS的數(shù)值可以得出FMPS硫酸酯化最佳條件為A3B2C3,即反應溫度100 ℃,氯磺酸與吡啶的比例1∶4,反應時間4 h,在此條件下多糖FMPS的硫酸基取代度可達到2.08。

表2 多糖FMPS硫酸酯化的正交試驗結果

2.2 紅外光譜分析結果

選取黃山花菇原糖和3種不同取代度的硫酸酯化多糖進行紅外光譜測定,結果如圖1所示。FMPS的紫外圖譜在文獻[5]中已被分析,表明其具有多糖特征峰、無硫酸基團。與未被硫酸化修飾的FMPS相比,3種硫酸化的多糖在3 600～3 200 cm-1、3 000～2 800 cm-1、1 400～1 000 cm-1處也出現(xiàn)了多糖的特征峰[14],并且出現(xiàn)了2個新的吸收峰。位于1 248 cm-1處的吸收峰歸因于非對稱的S=O伸縮振動;位于810 cm-1處的吸收峰是C—O—S的對稱振動峰[15-16]。紅外光譜圖表明FMPS的硫酸化修飾成功,進一步證實了—OSO3-1基團的加入。

圖1 不同硫酸基黃山花姑多糖的紅外光譜圖

2.3 抗腫瘤活性結果

抗腫瘤活性結果如圖2所示,從圖2可以看出，所有黃山花菇多糖對肝癌細胞HepG2都有一定的抑制作用,在相同質量濃度下硫酸酯化黃山花菇多糖FMPS-S對肝癌細胞的抑制活性明顯高于黃山花菇多糖FMPS。不同的硫酸化修飾黃山花菇多糖的抑制活性與質量濃度表現(xiàn)出不同的相互關系,FMPS-S2、FMPS-S3、FMPS-S4、FMPS-S5和FMPS-S8對HepG2的抑制活性隨著多糖質量濃度的增加而增強,在質量濃度為500 μg/mL時達到最大,抑制率分別為42.30%、9.95%、17.27%、16.25%、33.81%。FMPS-S1和FMPS-S9對HepG2的抑制活性隨著質量濃度的增加先增強后減弱,在質量濃度為100 μg/mL時具有最大活性,抑制率為8.25%和25.30%。FMPS-S6和FMPS-S7對HepG2的抑制活性隨著質量濃度的增加先增強后減弱,在質量濃度為200 μg/mL時具有最大活性,抑制率達到19.82%和16.44%。從圖2還可以看出,FMPS-S2在各個質量濃度下均有最好的腫瘤抑制活性,其硫酸基取代度為1.90,并不是所有硫酸化多糖中最高的,表明FMPS-S2有一個最佳的取代度以使其具有最好的腫瘤抑制活性。綜上所述,硫酸基取代度有一個最佳值，而不是越高越好,不同硫酸化條件得到的硫酸化黃山花菇多糖表現(xiàn)出最高抗腫瘤活性的最適質量濃度不同。

圖2 FMPS和FMPS-S對肝癌細胞HepG2的體外抑制作用

3 結 論

從正交試驗結果可以得出硫酸化修飾的最佳反應條件如下:反應溫度為100 ℃,氯磺酸與吡啶的比例為1∶4,反應時間為4 h,在該條件下黃山花菇多糖FMPS的硫酸基取代度可以達到最大值。體外抗腫瘤活性實驗結果表明,FMPS具有一定的抗腫瘤活性,硫酸化修飾使FMPS的抗腫瘤活性進一步提高,并且不同硫酸基取代度黃山花菇多糖的抗腫瘤活性表現(xiàn)出不同的質量濃度依賴性。