尚 進(jìn), 薛勁松, 葉佳偉, 項 玲, 劉騰飛, 肖桂然

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

近年來,我國人口出現(xiàn)生殖能力下降的現(xiàn)象,據(jù)報道,中國育齡婦女中不孕不育的比例已占已婚育齡婦女的1/6,而男性的精子合格率平均僅有不到20%。這些有關(guān)生殖的異?，F(xiàn)象需要引起高度重視,而探究生殖異常的原因和機制對于提高國民生殖能力和人口質(zhì)量也具有重要的意義。

動物體的生殖能力受很多方面影響,這包括遺傳因素和生活環(huán)境的影響,關(guān)于生殖能力的調(diào)控,目前還缺乏有效的手段。本文研究發(fā)現(xiàn),在果蠅中有一個基因Catsup在卵巢中突變后會顯著降低雌性果蠅的產(chǎn)蛋量,因此以Catsup為切入點,為探究影響生殖力的遺傳因素提供了契機。生物信息學(xué)分析顯示,Catsup和鋅離子轉(zhuǎn)運蛋白 ZIP 家族成員高度同源,其編碼的蛋白極可能是一個定位在高爾基體上的轉(zhuǎn)鋅蛋白[1]。鋅(Zinc)是人體必需的微量元素之一,在人體生長發(fā)育、生殖遺傳、免疫、內(nèi)分泌等重要生理過程中起著極其重要的作用[2-3]。有許多研究表明鋅與雄性動物的生殖能力有關(guān),有研究發(fā)現(xiàn)：鋅與精液的質(zhì)量與密度成正比;缺鋅影響精子的代謝與活動力,并影響睪丸的發(fā)育;缺鋅影響腦垂體功能,促使性腺分泌激素減少,使性腺發(fā)育受阻。但對于雌性動物生殖能力與鋅的研究較少,了解該問題能為相關(guān)疾病的治療提供新線索。

黑腹果蠅 (Drosophilamelanogaster) 是經(jīng)典的模式生物之一,其微量元素代謝過程與哺乳動物相比有較高的保守性,哺乳動物許多微量元素代謝相關(guān)的蛋白都能在果蠅中找到同源物[4-6]。由于果蠅具有生活周期短、飼養(yǎng)方便、遺傳背景清楚、繁殖力強和操作體系成熟等特點,使其作為模式生物用來研究微量元素代謝及生殖具有獨特的優(yōu)勢[7-8]。

本研究以果蠅為研究載體,探究基因Catsup表達(dá)水平對雌性果蠅生殖能力的影響及其產(chǎn)生影響的原因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

GAL4-UAS系統(tǒng)是實現(xiàn)果蠅體內(nèi)基因特異性敲低的常用手段,該系統(tǒng)由driver(GAL4) 和responder(UAS)2個調(diào)控元件組成,分別存在于2種轉(zhuǎn)基因果蠅中,2種果蠅雜交產(chǎn)生的后代同時含有這2種元件,GAL4啟動UAS下游基因細(xì)胞的組織特異性表達(dá)。

本研究所用的GAL4驅(qū)動子是C587-GAL4,該果蠅來自Bloomington Drosophila Stock Center,編號67747,它能特異地在果蠅的原卵區(qū)(inner germarium sheath,IGS)細(xì)胞和帽細(xì)胞(cap cell)中表達(dá)[9],實驗中,利用該驅(qū)動子實現(xiàn)卵巢微環(huán)境中特異性敲低Catsup基因;研究中所用到的野生型和Catsup-RNAi的果蠅均來源于Vienna Drosophila Research Center(VDRC),編號分別為60000和V100095。

1.2 果蠅飼養(yǎng)條件

果蠅培養(yǎng)基的制備。天平準(zhǔn)確稱取玉米粉100 g、大豆粉10 g、白糖14.5 g、紅糖40 g、酵母25 g、瓊脂8 g,蒸餾水1 L攪拌均勻并煮沸。食物冷卻至適當(dāng)溫度,加入防腐劑(2%),倒入果蠅培養(yǎng)管,冷卻凝固后即可使用。果蠅飼養(yǎng)的溫度為25 ℃,濕度65%。

1.3 生殖能力測定

每只果蠅培養(yǎng)管隨機放入9～12只處女蠅,3～5 只雄性雜交品系果蠅,在25 ℃下培養(yǎng),獲得子一代成年果蠅。每個基因型收集10組進(jìn)行平行實驗,每組培養(yǎng)管中放入1只果蠅(保證每組果蠅羽化時間相差不大),在溫度25 ℃下培養(yǎng)2 d后(保證成蠅性成熟,產(chǎn)蛋穩(wěn)定),在顯微鏡下計數(shù)產(chǎn)蛋情況并統(tǒng)計產(chǎn)蛋數(shù)量。每天將果蠅倒入新的管中連續(xù)統(tǒng)計,直到果蠅不再產(chǎn)蛋,將每天統(tǒng)計的產(chǎn)蛋數(shù)加和,即得到最終統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.4 卵巢形態(tài)的觀察

將各組果蠅用二氧化碳麻醉,挑選出雌蠅,置于解剖盤內(nèi)。在解剖盤中加入適量PBS緩沖液,并將之前挑選出的雌蠅放入其中,用剖腹針小心剖開果蠅腹部,往后牽拉出果蠅卵巢,去除果蠅卵巢周邊其他組織,得到完整的卵巢。準(zhǔn)備載玻片,滴上適量甘油(起到保護(hù)作用),將卵巢放到載玻片上,顯微鏡下觀察果蠅卵巢形態(tài)、大小變化并拍照。在實驗過程中不要破壞果蠅卵巢原來的形態(tài),以免對觀察結(jié)果造成影響。

1.5 卵巢的結(jié)構(gòu)觀察

為了標(biāo)記卵巢結(jié)構(gòu),本實驗中用到一個果蠅C587-GAL4、UAS-EGFP,這是利用遺傳手段將C587-GAL4與UAS-EGFP組合在一起。果蠅有4對同源染色體,利用果蠅減數(shù)分裂時的基因重組,將分別帶有C587-GAL4和UAS-EGFP的果蠅雜交,通過子代的表型篩選出同時帶有C587-GAL4和UAS-EGFP的果蠅。獲得的果蠅能夠在卵巢IGS細(xì)胞和帽細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光。借助于這個果蠅可以觀察到卵巢結(jié)構(gòu)。

用C587-GAL4、UAS-EGFP處女蠅分別與野生型和Catsup-RNAi果蠅雜交,獲得子一代。子一代果蠅羽化為成蟲后,將各組用二氧化碳麻醉,挑選出雌蠅,在PBS緩沖液的環(huán)境下剖開果蠅腹部,得到卵巢。將解剖好的卵巢用4%的多聚甲醛固定10 min,隨后用PBS緩沖液洗去多聚甲醛,最后處理后的卵巢放在載玻片上,滴上甘油用以緩沖并維持卵巢形態(tài),在激光共聚焦顯微鏡5倍鏡下觀察卵巢的綠色熒光情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲低Catsup對果蠅生殖能力的影響

產(chǎn)蛋的數(shù)量是恒量雌性果蠅生殖能力的重要指標(biāo)。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)Catsup敲低后雌性果蠅產(chǎn)蛋量明顯降低,統(tǒng)計結(jié)果如圖1所示,野生型雌果蠅在羽化后大約產(chǎn)蛋330個,而Catsup敲低后果蠅產(chǎn)蛋量顯著下降,只有不到100個。這說明Catsup基因所控制的某種機制對雌性果蠅的生殖能力有至關(guān)重要的作用。

圖1 敲低Catsup果蠅與野生型果蠅產(chǎn)蛋情況對比

2.2 敲低Catsup對果蠅卵巢形態(tài)的影響

卵巢是雌性果蠅的生殖器官,每只雌果蠅有2個卵巢,每個卵巢由10～20根輸卵管構(gòu)成。果蠅卵巢的尖端部位有2或3個生殖系干細(xì)胞,它們通過不對稱有絲分裂產(chǎn)生1個新的子干細(xì)胞和1個包囊干細(xì)胞,包囊干細(xì)胞又進(jìn)行連續(xù)4次胞質(zhì)分裂不完全的有絲分裂,產(chǎn)生16個相互連通的包囊細(xì)胞,形成包囊,并被體細(xì)胞來源的濾泡細(xì)胞所包圍,形成卵室。其中1個包囊細(xì)胞成為卵母細(xì)胞,另外15個包囊細(xì)胞則成為營養(yǎng)細(xì)胞。由圖1可知，Catsup基因敲低的果蠅產(chǎn)蛋數(shù)量明顯降低,而卵巢是雌果蠅的排卵器官,因此本實驗對果蠅的卵巢進(jìn)行研究。

解剖Catsup-RNAi雌果蠅的卵巢后,發(fā)現(xiàn)野生型果蠅的卵巢則比較飽滿,而Catsup-RNAi果蠅的卵巢出現(xiàn)嚴(yán)重皺縮的現(xiàn)象,如圖2所示,本實驗結(jié)果顯示,Catsup敲低后雌性果蠅的形態(tài)嚴(yán)重畸形,可以推測其卵巢的功能也出現(xiàn)損傷。

2.3 Catsup敲低對果蠅卵巢結(jié)構(gòu)的影響

為了進(jìn)一步探究在果蠅卵巢中敲低Catsup對卵巢的影響,本實驗用C587-GAL4、UAS-EGFP來驅(qū)動Catsup-RNAi的表達(dá),得到的子代果蠅卵巢部位帶有熒光,便于觀察卵巢的結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)如圖3所示。本研究發(fā)現(xiàn),相比于野生型(control)果蠅,Catsup敲低組卵巢部位的熒光明顯變?nèi)?而且突變果蠅卵室變得松散,不如野生型緊湊。熒光變?nèi)醯脑蚩赡苁莕iche出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡或壞死,這也是導(dǎo)致果蠅產(chǎn)蛋數(shù)量嚴(yán)重減少的可能原因之一;而卵巢結(jié)構(gòu)松散則可能是Catsup敲低后導(dǎo)致細(xì)胞間粘連的蛋白減少。

圖3 敲低Catsup果蠅卵巢結(jié)構(gòu)觀察

3 結(jié) 論

本文發(fā)現(xiàn)果蠅基因Catsup在卵巢表達(dá)量降低后,顯著影響果蠅生殖能力,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),果蠅卵巢中Catsup-RNAi后卵巢形態(tài)發(fā)生很大改變,并且卵巢內(nèi)部結(jié)構(gòu)、卵室之間的連接已經(jīng)被破壞。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究Catsup影響果蠅生殖能力提供了有力的奠基。

如前文所述,Catsup是果蠅體內(nèi)的一種鋅轉(zhuǎn)運蛋白同源物,因此探究Catsup的分子功能對于解析Catsup引起的生殖障礙的分子機制具有至關(guān)重要的作用。眾所周知,鋅對于發(fā)育及代謝具有至關(guān)重要的作用[10],影響到體內(nèi)很多重要基因的轉(zhuǎn)錄過程[11]。本研究推測可能Catsup具有鋅離子轉(zhuǎn)運功能,表達(dá)水平改變會影響到細(xì)胞內(nèi)鋅的穩(wěn)態(tài),進(jìn)而影響卵巢的發(fā)育,從而影響了生殖能力;或者鋅水平的紊亂影響到生殖過程所需要的某些重要基因的表達(dá),從而影響了生殖能力?？傊?本研究發(fā)現(xiàn)Catsup對果蠅的生殖過程產(chǎn)生了重要的影響,該研究為后續(xù)探究鋅代謝與雌性生殖提供參考價值。