何 鵬，唐 巍，童明月，豐麗媛，王 玉，姚曉雯，李夢醒

(1.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，安徽 合肥 230012)

腦卒中分為缺血性和出血性兩類，其中缺血性腦卒中占腦卒中總數(shù)的60%以上，發(fā)病率、致殘率高，是60歲以上人群首要死亡病因[1-2]。缺血性腦卒中病灶的病理變化主要為缺血低氧引起的腦組織水腫以及神經(jīng)細胞凋亡。以往許多研究[3]著眼于對神經(jīng)細胞的調(diào)控以降低腦缺血后損傷，而忽略新生微血管在促進神經(jīng)功能恢復方面的作用。近來有研究[4]表明，腦梗死區(qū)域的新生微血管具有改善局部血流灌注，促進側(cè)支循環(huán)形成的作用。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)是血管新生中的重要因子。文獻研究[5]發(fā)現(xiàn)，通過正向調(diào)控血管新生相關通路[磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)/eNOS]下游因子eNOS和NO的表達，可以達到改善神經(jīng)功能的目的。電針干預可增加缺血區(qū)域腦血流量，使梗死體積縮小，促進神經(jīng)功能恢復，其機制可能與血管新生有關。故本實驗以大腦中動脈栓塞(middle cerebralartery occlusion，MCAO)大鼠為模型，探討電針能否通過調(diào)節(jié)血管新生相關因子eNOS、NO的表達來促進血管新生，改善神經(jīng)功能缺損體征，達到腦保護作用。

1 材料

1.1 動物 健康雄性SD大鼠(SPF級)42只，體質(zhì)量為280～320 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2019-0003]，于動物房適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗，動物房溫度保持為20～25 ℃，濕度為60%左右，通風。本實驗獲得安徽中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 試劑 TTC染色液:美國Sigma公司；NO試劑盒：南京建成生物工程研究所；Western 一抗、二抗去除液：Beyotime；ECL超敏發(fā)光試劑盒：Thermo；eNOS試劑盒：Bioss；β-Actin、山羊抗小鼠IgG：Zs-BIO；SDS：Solarbio。

1.3 儀器 華佗牌毫針(0.30 mm×25 mm)、華佗牌SDZ-Ⅳ型電子針療儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；Leica RM2135切片機：德國Leica；Nikon顯微鏡：日本Nikon；亞光YB-7B石蠟包埋機：湖北省亞光醫(yī)用電子技術有限公司；自動曝光儀：上海培清科技有限公司；超低溫冰箱：中國Haier公司。

2 方法

2.1 電針干預方法 參照《實驗針灸學》[6]，結(jié)合大鼠解剖結(jié)構進行定位，電針組取“百會”“風府”“心俞”“內(nèi)關”4個穴位，以模型復制后4 h為第1天開始治療，取0.30 mm×25 mm毫針針刺大鼠以上4個穴位，連接華佗牌SDZ-Ⅳ型電子針療儀，取“百會”和“風府”為一組，同側(cè)“內(nèi)關”和“心俞”為一組，近心端穴位接正極，遠心端穴位接負極，每日1次，每次20 min。電針參數(shù)：疏密波，5～100 Hz，電壓3～5 V，以大鼠肢體輕度抖動不嘶叫、不掙扎為度。

2.2 動物分組及模型復制方法 隨機抽取14只大鼠作為假手術組，只打開大鼠皮下組織鈍性分離其頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈。其余大鼠參照Longa線栓法[7]復制MCAO大鼠模型。取10%烏拉坦(1.2 g/kg)腹腔注射，麻醉(翻正反射消失)固定后，在大鼠頸部正中偏右0.5～1 cm處豎直方向剪一個2 cm左右小口，鈍性分離其組織，使頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈充分暴露，在頸外動脈遠心端打死結(jié)固定，并于向顱一側(cè)凝斷，輕拉游離端，使之與頸內(nèi)動脈成一平角，遠心端夾閉頸總動脈與頸內(nèi)動脈，在游離端上45°角斜剪一小口，將蘸有清漆并過夜的合適漁線沿小口插入頸內(nèi)動脈，松開動脈夾，漁線插至微有阻力處停下，固定、縫合切口，肌注0.5 mL青霉素。待大鼠清醒后遵5分制標準[8]進行神經(jīng)功能缺損評分，1～3分即為模型復制成功。將最終模型復制成功的大鼠隨機分為模型組和電針組兩組，每組14只。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評分 各組大鼠在治療7 d后按5分制標準[8]評分：無神經(jīng)功能缺損體征者計為0分；大鼠左側(cè)肢體屈曲，無法充分伸展計為1分；大鼠移動時偏向左側(cè)繞圈計2分；大鼠向左側(cè)傾倒計3分；喪失意識計4分。

2.3.2 大鼠腦梗死體積觀察及檢測 采用TTC染色法檢測腦梗死體積。每組取6只大鼠，10%烏拉坦(1.2 g/kg)腹腔注射，麻醉后斷頭取腦，放入-20 ℃冰箱凍存15 min后橫向連續(xù)切2 mm厚片，置于2% TTC染液中，以錫紙包裹，37 ℃水浴箱中溫育20 min上色，4%多聚甲醛固定。結(jié)束后數(shù)碼相機拍照，Image Pro-Plus 6.0軟件測量腦梗死體積：V=l(A1+A2+A3+……+An)-(A1+An)×l/2。試中l(wèi)為切片厚度，A為每張切片的梗死面積，V為梗死灶體積。

采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法觀察缺血區(qū)大腦皮質(zhì)病理學改變。每組取2只大鼠，取腦，切片，二甲苯常規(guī)脫蠟后水洗，伊紅染色后脫水，封片，Nikon顯微鏡(400倍)下觀察細胞病理學改變并攝片保存。

2.3.3 Western blot法檢測缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS蛋白的相對表達量 每組取3只大鼠，麻醉后脫頸處死，快速取腦，剪取缺血區(qū)大腦皮質(zhì)100 mg，加RIPA細胞裂解液(內(nèi)含1 mmol/L PMSF)進行裂解。12 000 r/min離心10 min。取出上清液，電泳，轉(zhuǎn)膜，添加一抗、二抗，ECL發(fā)光試劑盒檢測蛋白，Image J軟件分析目標條帶灰度值，計算其相對表達量。

2.3.4 ELISA法檢測大鼠外周血清NO含量 各組選取3只大鼠，麻醉后打開腹腔，手持干凈棉球移開腸胃，夾閉腹主動脈后用采血針從遠心端向心刺入，取血3 mL，4 ℃冰箱內(nèi)保存，再按試劑盒說明取血漿進行前處理，測定NO含量。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 假手術組大鼠無神經(jīng)功能缺損體征，評分皆為0分；與假手術組比較，模型組、電針組大鼠神經(jīng)功能缺損體征明顯(P<0.05)；與模型組比較，電針組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著降低(P<0.05)，表明偏癱程度較輕，神經(jīng)功能恢復更好。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

3.2 各組大鼠腦梗死體積比較 假手術組大鼠腦部切片未見明顯梗死區(qū)域；與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死體積顯著增大(P<0.05)；與模型組比較，電針組大鼠腦梗死體積顯著縮小(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腦梗死體積比較(TTC染色)

表2 各組大鼠腦梗死體積比較

3.3 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)腦組織的組織形態(tài)學變化比較 假手術組：細胞結(jié)構完整，細胞質(zhì)均勻分布，細胞核呈紫色并且形狀規(guī)則，無炎癥細胞浸潤現(xiàn)象，染色均勻，細胞呈正常形態(tài)。模型組：可見大量皺縮的細胞聚集，排列紊亂，細胞核變形溶解甚至消失，細胞結(jié)構紊亂無序，形狀不規(guī)則，細胞質(zhì)呈藍紫色。電針組：相對于假手術組而言，可見細胞數(shù)目明顯減少，部分細胞核皺縮，細胞排列較為紊亂，細胞染色分布不均勻；相對于模型組而言，細胞結(jié)構較為清晰，染色較為均勻，細胞核形狀相對規(guī)則且完整。見圖2。

圖2 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)組織形態(tài)學變化比較(HE染色，10×40倍)

3.4 各組大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS蛋白表達水平和血清NO含量比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS蛋白相對表達水平和血清NO含量均顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，電針組大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS蛋白相對表達水平和血清NO含量均顯著增高(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 各組大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS蛋白表達電泳圖

表3 各組大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS相對表達水平和血清NO含量比較

4 討論

缺血性腦卒中可歸屬于中醫(yī)學“中風”范疇，病機為氣血逆亂，血瘀于腦，因其病位在腦，根據(jù)《靈樞》所言“腦為髓之海，其輸上在于其蓋(百會穴)，下在風府”，所以取百會、風府二穴，符合“氣街”理論[9]?！夺t(yī)學衷中參西錄》中有言“人之神在腦，心腦息息相通”，是以“心”與“腦”緊密相連，背俞穴是臟腑之氣匯聚處，常被用來治療臟腑疾病，根據(jù)“陽中求陰”理論取心的背俞穴“心俞”[10]；而心包為心之外衛(wèi)，與心緊密相連，是以再配合通于陰維脈的心包經(jīng)之內(nèi)關穴來協(xié)調(diào)心經(jīng)之氣機[11]。課題組前期研究[12-15]表明，針刺可結(jié)合現(xiàn)代康復醫(yī)學理念在腦卒中后遺癥的不同階段采用不同的針灸策略治療偏癱患者，電針可有效縮小大鼠腦梗死體積，改善腦卒中大鼠神經(jīng)功能缺損體征，所以本實驗基于“腦心同治”的治療原則[16]選取“百會”“風府”“心俞”“內(nèi)關”4個穴位進行電針干預治療，探討其效應機制。

缺血性腦卒中發(fā)生后，腦的供血動脈閉塞或狹窄造成腦組織缺血低氧性壞死[17]，而在缺血區(qū)域新生的微血管具有改善其周圍組織血液循環(huán)灌注的作用[18]，促進周圍組織中神經(jīng)細胞的修復，有利于改善神經(jīng)功能，故促進血管新生已成為腦卒中后的研究重點。資料[19-20]顯示，當組織受損處于缺血低氧環(huán)境時，血管新生相關通路PI3K/AKT/eNOS可被激活，其下游因子eNOS磷酸化后可介導生成eNOS，這類eNOS調(diào)控生成的NO是一種可特異性作用于內(nèi)皮祖細胞的血管新生因子，可以促進其特異性分泌進入外周血中，借助細胞因子的黏附作用，遷移至血管內(nèi)皮破損處分化為內(nèi)皮細胞，參與血管新生進程，加速微血管新生成網(wǎng)，促進側(cè)支循環(huán)的建立。研究[21-23]表明，在缺血發(fā)生早期，eNOS和NO的高表達可加速血管新生過程，促進腦缺血區(qū)域的循環(huán)重建。在本實驗中，電針組大鼠腦梗死體積、神經(jīng)功能缺損評分、eNOS和NO表達量均顯著優(yōu)于模型組，提示在卒中發(fā)生后大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS含量顯著下降，但經(jīng)電針治療后eNOS含量明顯上升，且顯著優(yōu)于模型組，其所介導產(chǎn)生的NO含量亦顯著優(yōu)于模型組，這說明電針干預可有效改善大鼠神經(jīng)功能缺損體征，降低腦梗死區(qū)體積，上調(diào)eNOS蛋白及NO表達量，促進缺血區(qū)域的血管新生，與以往研究結(jié)果相符。

綜上所述，電針MCAO大鼠“百會”“風府”“心俞”“內(nèi)關”4個穴位可上調(diào)大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS蛋白與NO的表達，這對于縮小腦缺血大鼠腦梗死體積，促進血管新生與神經(jīng)功能恢復，支持缺血性腦卒中后側(cè)支循環(huán)重建，減輕腦缺血帶來的損傷有一定的臨床意義。但是，目前對于eNOS/NO通路的基礎研究成果較少，課題組后續(xù)研究可以此為重點，擴大樣本量，增加腦缺血早期樣本指標檢測量，進一步研究電針對eNOS/NO通路作用的具體調(diào)控機制和網(wǎng)絡，嘗試闡述eNOS/NO路徑發(fā)揮其生物學作用的具體機制，以及其效應隨時間變化的機制等。