張新霞，謝 超，王志強(qiáng)，高 泓

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生著巨大的變化，糖尿病(diabetes mellitus，DM)成為一種十分常見的疾病[1]。目前我國大約有9500萬DM患者[2]。研究[3]表明：每周進(jìn)行1次以上的運(yùn)動(dòng)者糖尿病的發(fā)病率減少。運(yùn)動(dòng)可以調(diào)節(jié)內(nèi)分泌代謝并且使得肌肉利用葡萄糖和游離脂肪酸，有效抑制餐后血糖的升高，實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)血糖的作用。糖尿病患者多運(yùn)動(dòng)不僅可以增強(qiáng)其代謝能力，還可以降低血酮體[4]。王宏[5]的研究表明：運(yùn)動(dòng)還能增加體內(nèi)的免疫功能，改善腦細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力。該研究旨在探討運(yùn)動(dòng)療法對(duì)鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠病理損傷及骨骼肌FOXO1、GLUT4表達(dá)的影響，以期了解運(yùn)動(dòng)療法對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠病理損傷及骨骼肌FOXO1、GLUT4表達(dá)的影響作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)雄性Wistar大鼠75只，購自北京維通利華公司；動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2017-0022，飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥物與試劑鏈脲佐菌素(純度>99.9%，CAS號(hào)：18883-66-4)購自上海翊圣生物科技有限公司；白細(xì)胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、白細(xì)胞介素-10 (interleukin-10, IL-10)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒子購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA) 、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒均購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)抗體購自武漢華聯(lián)科有限公司；甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白-膽固醇(low density lipoprotein, LDL)及高密度脂蛋白-膽固醇(high density lipoprotein, HDL)試劑盒均購自北京中生生物試劑公司；蘇木精、伊紅購自武漢博士得生物有限公司；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司; TRIzol 試劑購自Thermo Fisher公司。

1.3 儀器全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)：Sysmex-chemix-180)購自日本Furuno Electric公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；電子天平(型號(hào)：BS-124s)購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；臺(tái)式離心機(jī)(型號(hào)：TDL-5)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；光學(xué)顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；切片機(jī)購自德國Leica公司；低溫離心機(jī)購自湖南恒諾離心機(jī)有限公司。

1.4 方法

1.4.1建立模型 按照俞韓 等[6]研究方法。將所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食1 d。將鏈脲佐菌素(STZ)溶解于檸檬酸的緩沖溶液中，調(diào)節(jié)pH值，使pH值保持在4左右，將配置好的STZ溶液從大鼠的尾部靜脈注射，其注射量為55 mg/kg，若有死亡及時(shí)補(bǔ)充。36 h后測(cè)空腹血糖(fasting blood-glucose, FBG)，當(dāng)血糖含量≥16.7 mmol/L時(shí)可以認(rèn)為模型建立成功。

1.4.2分組及干預(yù) 將75只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為:健康對(duì)照組、模型組、低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組，每組各15只。其中健康對(duì)照組不做任何處理，正常飼養(yǎng)；除了健康對(duì)照組以外的60只大鼠全部制成糖尿病模型；其中模型組大鼠采用自由活動(dòng)，低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組所有大鼠采用低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠采用中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)；高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組采用高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，所有大鼠每天運(yùn)動(dòng)1 h，每周6 d，連續(xù)干預(yù)28 d。具體運(yùn)動(dòng)方式和運(yùn)動(dòng)程序參考Fernando et al[7]方法：采用跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，適應(yīng)性訓(xùn)練3 d，休息1 d后正式訓(xùn)練。低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組跑速10 m/min(相當(dāng)于30%最大耗氧量)、中強(qiáng)度普通運(yùn)動(dòng)組跑速15 m/min(相當(dāng)于50%最大耗氧量)、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組跑速20 m/min(相當(dāng)于70%最大耗氧量)，坡度均為0。

1.4.3檢測(cè)項(xiàng)目

1.4.3.1 HE染色觀察大鼠腓腸肌 HE染色觀察各組大鼠腓腸肌，使用二甲苯浸泡、不同梯度酒精脫水、蘇木精浸泡、鹽酸酒精分化、沖洗、伊紅染色、酒精浸泡、二甲苯浸泡，最后中性樹膠封片、觀察。

1.4.3.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 取大鼠大鼠腓腸肌，使用剪刀剪碎后使用濾網(wǎng)過濾，制成懸液，使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測(cè)蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，TBS洗凈，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 嚴(yán)格按照全自動(dòng)生化檢測(cè)儀使用方法檢測(cè)大鼠血清TG、TC、LDL、HDL含量變化。

1.4.3.4 ELISA法檢測(cè)大鼠炎癥因子 從大鼠頸總動(dòng)脈插管接取0.5 ml血液，按照試劑盒說明書檢測(cè)大鼠血清中的IL-6、IL-10及TNF-α含量。

1.4.3.5 生物化學(xué)方法測(cè)定 使用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定大鼠骨骼肌組織中SOD的活性[8]；使用硫代巴比妥酸法檢測(cè)大鼠病骨骼肌組織中MAD含量[9]；使用生化法檢大鼠病骨骼肌組織中LDH含量[10]。

1.4.3.6 基因檢測(cè) 用TRIzol試劑提取各組骨骼肌總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，用SYBR PCR Master Mix試劑盒對(duì)FOXO1和GLUT4表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 HE染色腓腸肌結(jié)果健康對(duì)照組腓腸肌肌肉組織、肌外膜、肌纖維均正常；模型組大鼠腓腸肌鏡下部分肌纖維彎曲，肌紅蛋白溶解，肌細(xì)胞核固縮、溶解，肌束膜破裂；低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠腓腸肌少量肌纖維斷裂溶解彎曲，余未見異常；中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠腓腸肌肌肉組織、肌外膜、肌纖維基本無顯著異常，較為完整，肌纖維縱切面可見周期性橫紋(明暗相間帶)；高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組鼠腓腸肌少量肌纖維斷裂溶解彎曲，余未見異常。見圖1。

圖1 HE染色腓腸肌觀察結(jié)果 ×200A：健康對(duì)照組；B：模型組；C：低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組；D：中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組；E：高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組

2.2 蛋白質(zhì)印記檢測(cè)大鼠骨骼肌相關(guān)凋亡因子水平結(jié)果與健康對(duì)照組相比，模型組大鼠骨骼肌中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組相比，低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2 蛋白質(zhì)印記檢測(cè)大鼠骨骼肌相關(guān)凋亡因子水平結(jié)果

表1 骨骼肌相關(guān)凋亡因子水平

2.3 大鼠生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果與健康對(duì)照組相比，模型組大鼠血糖、TC、TG、LDL升高、HDL降低(P<0.05)；與模型組相比，低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠血糖、TC、TG、LDL降低、HDL升高(P<0.05)；與低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠血糖、TC、TG、LDL降低、HDL升高(P<0.05)；與中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠血糖、TC、TG、LDL升高、HDL降低(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.4 ELISA法檢測(cè)大鼠炎癥因子結(jié)果由表3可以看出，與健康對(duì)照組相比，模型組大鼠IL-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；與模型組相比，低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)；與低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)；與中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠L-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)。

表3 大鼠炎癥因子結(jié)果

2.5 生物化學(xué)方法測(cè)定大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)物質(zhì)活性與健康對(duì)照組相比，模型組大鼠SOD水平降低，LDH、MAD水平升高(P>0.05)；與模型組相比，低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠SOD水平升高，LDH、MAD水平降低(P>0.05)；與低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠SOD水平升高，LDH、MAD水平降低(P>0.05)；與中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠SOD水平降低，LDH、MAD水平升高(P>0.05)。見表4。

表4 氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)物檢測(cè)結(jié)果

2.6 大鼠骨骼肌FOXO1、GLUT4 mRNA和蛋白表達(dá)水平與健康對(duì)照組相比，模型組大鼠骨骼肌中FOXO1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高、GLUT4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組相比，低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骼肌中FOXO1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低、GLUT4 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骼肌中FOXO1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低、GLUT4 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；相比中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌中FOXO1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高、GLUT4 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖3、表5。

圖3 大鼠骨骼肌FOXO1、GLUT4蛋白及mRNA表達(dá)水平

表5 大鼠骨骼肌FOXO1、GLUT4蛋白及mRNA表達(dá)水平

3 討論

骨骼肌損傷后肌細(xì)胞核會(huì)固縮、溶解，肌束膜破裂。本研究通過HE染色腓腸肌發(fā)現(xiàn)，使用運(yùn)動(dòng)療法治療后，大鼠腓腸肌肌外膜完整，可見血管及神經(jīng)；肌束膜包裹肌纖維，肌纖維完整，肌細(xì)胞核大小形態(tài)未見異常。說明使用運(yùn)動(dòng)療法后，大鼠骨骼肌的損傷得到了有效的緩解。

糖尿病是目前腎臟病主要原因之一，其原因和自由基有密切關(guān)系。這些自由基可以促進(jìn)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)使得患者體內(nèi)相關(guān)炎癥反應(yīng)加劇。目前研究較多的促炎性細(xì)胞因子包括：TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-8 等；抗炎性細(xì)胞因子則包括：IL-4、IL-10、白介素-1等。同時(shí)也會(huì)使得糖尿病患者血清中的TC、TG、LDL增多，也會(huì)使血壓升高，損傷到血管內(nèi)皮，這也是糖尿病會(huì)惡性循環(huán)，不斷加重病情的原因之一，所以抗氧化對(duì)于預(yù)防和延緩糖尿病的慢性并發(fā)癥有重要作用。本研究顯示，接受運(yùn)動(dòng)療法后的大鼠體內(nèi)相關(guān)炎癥因子IL-6、TNF-α降低，抗炎癥因子升高。說明運(yùn)動(dòng)療法可以有效降低大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，且中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)療法效果最佳。朱雪麗 等[11]研究表明：運(yùn)動(dòng)療法可有效地控制微炎癥狀態(tài)，與本研究得出的結(jié)論相一致。本研究表明接受運(yùn)動(dòng)療法后的大鼠體內(nèi)血糖、TC、TG、LDL降低，HDL升高?？航▏鳾12]的研究表明：糖尿病大鼠血糖與脂代謝具有相關(guān)性，且兩者相互影響，降低了血脂，糖尿病也得到了改善，與本研究得出的結(jié)論相一致。

細(xì)胞凋亡是一種在形態(tài)學(xué)上和壞死完全不同的細(xì)胞死亡類型。Caspase家族基因是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因。Caspase 家族中主要調(diào)控凋亡的基因包括：Caspase-3和Caspase-9，其中Caspase-9可以裂解促進(jìn) proCaspase-3 產(chǎn)生有活性的 Caspase-3。剪切另外的 Caspase 底物，達(dá)到引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)顯示，使用運(yùn)動(dòng)療法后大鼠體內(nèi)的Caspase-3和Caspase-9水平降低，說明大鼠骨骼肌細(xì)胞的凋亡受到了抑制，有效保護(hù)糖尿病大鼠的骨骼肌。譚小梅[13]的研究表明：降低體內(nèi)Caspase-3和Caspase-9的水平可以有效抑制體內(nèi)細(xì)胞的凋亡，減少機(jī)體的損傷，本研究得出的結(jié)論與之相一致。

氧化應(yīng)激是加重大鼠糖尿病的重要原因之一，其中SOD和MAD含量可反映氧化應(yīng)激的程度。除了SOD和MAD，LDH的含量也可以反映氧化應(yīng)激的程度，當(dāng)細(xì)胞損傷LDH會(huì)由胞內(nèi)釋放到胞外。本研究發(fā)現(xiàn)，使用運(yùn)動(dòng)療法后SOD水平升高、LDH、MAD水平降低，說明大鼠體內(nèi)氧化受到了抑制，降低了細(xì)胞損傷的程度。鞠禮 等[14]研究表明：降低體內(nèi)過氧化反應(yīng)可以有效緩解糖尿病癥狀，本研究得出的結(jié)論與之相一致。

糖尿病患者GLUT4的囊泡向胞膜移動(dòng)，使得患者者血清內(nèi)GLUT4含量水平會(huì)減少。本研究顯示，使用運(yùn)動(dòng)療法后大鼠FOXO1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低、GLUT4 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，說明運(yùn)動(dòng)療法可以調(diào)節(jié)大鼠血糖、血脂及炎癥反應(yīng)，降低大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)可以有效緩解大鼠糖尿病的進(jìn)展。Armoni et al[15]研究表明：降低FOXO1表達(dá)、升高GLUT4可以有效降低炎癥反應(yīng)，本研究得出的結(jié)論與之相一致。

綜上，運(yùn)動(dòng)療法可以通過升高骨骼肌GLUT4蛋白及mRNA表達(dá)水平、降低骨骼肌FOXO1蛋白及mRNA表達(dá)水平緩解糖尿病大鼠病理損傷，且中等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度效果最佳。