黃婉莉，劉宇，胡耀狄，高基民

溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035

肝細胞癌 (Hepatocelluar carcinoma，HCC)是一種侵略性癌癥，也是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌約90%[1]。目前手術(shù)切除、肝移植和肝動脈化療栓塞術(shù) (Transarterial chemoembolization，TACE) 是治療早期HCC患者的主要策略[2-3]，但是大多數(shù)肝細胞癌患者確診時已是晚期，這些治療并沒有產(chǎn)生顯著的效果。索拉替尼、雷戈非尼、樂伐替尼等是美國食品藥品監(jiān)管局 (Food and drug administration，F(xiàn)DA) 批準的治療晚期HCC的一線或二線藥物，其臨床療效存在一定的局限性[4-7]。因此迫切需要開發(fā)新的策略治療晚期HCC患者。

嵌合抗原受體 (Chimeric antigen receptor，CAR) 修飾的T細胞免疫療法已被證實是一種非常有希望的腫瘤治療策略[8]，其可以特異性識別腫瘤相關(guān)抗原，并以非主要組織相容復合物 (Major histocompatibility complex，MHC) 限制的方式消除腫瘤細胞[9-10]。CAR主要由識別并結(jié)合腫瘤細胞表面抗原的胞外單鏈抗體可變片段 (Single chain antibody fragment，scFv)、跨膜段和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導/激活域組成。第二代/第三代CAR-T細胞在第一代的基礎(chǔ)之上加入一個/兩個共刺激分子如CD28、4-1BB等從而增強了CAR-T細胞活化、增殖和生存能力。第四代CAR-T (又被稱為“TRUCK”) 則在傳統(tǒng)的CAR載體上增加了編碼細胞因子的基因，其可以分泌IL-12、IL-15等細胞因子，從而改善CAR-T細胞的擴增和持久性，提升其對于免疫抑制腫瘤微環(huán)境的抵抗力[11]。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (Glypican-3，GPC3)是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖Glypican家族成員的一種，其通過糖基磷酰肌醇 (Glycosylphosphatidylinositol，GPI) 錨定在細胞表面。GPC3核心蛋白由580個氨基酸組成，大小為70 kDa。其已被證明在HCC中高表達，而在大多數(shù)健康的成年器官中無法檢測到[12-15]，GPC3對于HCC來說是一種有意義的診斷、治療和預后評估的生物標志物。因此它可以作為有希望的腫瘤相關(guān)抗原，用于構(gòu)建靶向HCC的CAR-T細胞。事實上，已有研究者構(gòu)建了靶向GPC3的第二/三代CAR-T細胞，并在動物體內(nèi)驗證了其對于細胞株或患者來源的GPC3陽性肝細胞癌移植瘤的治療效果[16-17]。

雖然CAR-T療法在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得了重大突破，比如2017年靶向CD19的兩種CAR-T細胞產(chǎn)品Kymriah和Yescarta被FDA分別批準為治療復發(fā)/難治性急性B淋巴細胞白血病和難治性大B細胞淋巴瘤的首選治療方式[18-19]，但是目前CAR-T細胞對實體瘤的療效依然有限。原因是多方面的：實體瘤表面往往表達多種不同的抗原，因此缺乏腫瘤特異性靶標；腫瘤免疫微環(huán)境的存在可以抑制CAR-T細胞活性；CAR-T細胞體內(nèi)的存活時間短等。

本研究中我們構(gòu)建了一種靶向GPC3的第四代CAR-T細胞 (分泌IL-7和CCL19)。其中IL-7是T細胞穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，可以促進T細胞擴增，對維持體內(nèi)T細胞存活及持久性具有重要作用[20-21]。CCL19屬于CC類趨化因子，可以募集T細胞和樹突狀細胞 (Dendritic cell，DC) 浸潤到腫瘤發(fā)生部位[22-23]。本研究通過體外比較第四代GPC3 CAR-T細胞 (GPC3-BBZ-7×19) 與第二代GPC3 CAR-T細胞 (GPC3-BBZ) 在增殖、遷移、亞型和殺傷等功能方面的差異，以及體內(nèi)觀察GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞對免疫缺陷小鼠體內(nèi)HCC移植瘤的作用效果，期望為GPC3陽性的肝細胞癌提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

慢病毒載體pLenti-T2A-Luc-GFP、包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2和pMD2G由本實驗構(gòu)建并保存。靶向GPC3的單克隆抗體可變區(qū) (4A11) 從專利[24]獲取。IL-7和CCL19基因片段由蘇州金唯智科技有限公司合成。人腎上皮細胞系HEK293T和人急性T細胞白血病細胞系Jurkat購于美國菌種保藏中心 (American type culture collection，ATCC)。人肝癌細胞系Huh7、Hep3B和HepG2由中國科學院細胞庫提供。無特定病原體 (Specific pathogen-free，SPF) 級雄性、4–6周齡的 NCG(NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52 Il2rgem26Cd22/Gpt)小鼠購自南京集萃藥康生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK (蘇) 2019-0009。小鼠飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心的SPF級實驗室，動物飼養(yǎng)許可證號為SYXK (浙) 2015-0009。本研究中動物實驗嚴格按照溫州醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物管理委員會制定的動物倫理條例進行相關(guān)操作。

1.1.2 實驗試劑

TransStbl3感受態(tài)購于上海桑尼生物技術(shù)公司；DNA膠回收試劑盒購于美國Axygen公司；限制性內(nèi)切酶購于美國New England BioLabs公司；無縫克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自德國QIAGEN公司；PE抗人CD3抗體、APC抗人CD45RA抗體、FITC抗人CD45RO抗體、PB抗人CD62L抗體、APC抗人IFN-γ抗體均購自美國BioLegend公司；鼠抗人GPC3單克隆抗體和FITC標記的驢抗鼠IgG(H+L) 抗體、PE標記的鏈親和素 (PE-SA) 購自美國Thermo Fisher 公司；生物素標記的F(ab′)2片段化羊抗人IgG購于美國eBioscience公司；FITC標記的人GPC3蛋白購自美國AcroBiosystems公司；IL-7和GM-CSF細胞因子檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；CCL19細胞因子檢測試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；重組人IL-2購于美國Prprotech公司。D-(-)-熒光素購自上海甄準生物科技有限公司；聚凝胺 (polybrene)購自美國Sigma公司；聚乙酰亞胺 (Polyetherimide，PEI) 購于美國Sigma公司。細胞培養(yǎng)基以及添加劑均購于美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒表達載體的構(gòu)建及其包裝

GPC3 CAR由靶向GPC3的4A11單克隆抗體的單鏈可變區(qū)與人CD8α、4-1BB和CD3ζ組成。設(shè)計引物 (表1) 對GPC3 CAR片段和人源IL-7-CCL19片段進行PCR，再通過重疊延伸PCR將IL-7-CCL19片段與GPC3 CAR片段連接 (3個片段中間以2A自剪切肽隔開)，以MluⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位點酶切慢病毒表達載體pLenti-T2ALuc-GFP，通過無縫克隆將GPC3 CAR片段和GPC3 CAR-IL-7-CCL19片段分別插入載體中構(gòu)建第二代CAR慢病毒載體GPC3-BBZ和第四代CAR慢病毒載體GPC3-BBZ-7×19。

質(zhì)粒通過第三代慢病毒包裝系統(tǒng)進行病毒包裝：準備EP管，并加入適量的PBS，在第1管PBS中分別加入一定量的目的質(zhì)粒GPC3-BBZ/GPC3-BBZ-7×19與包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2、pMD2G；在第2管PBS中加入PEI，室溫孵育5 min；將第2管混合物加入第1管中，輕柔混勻并室溫孵育20 min，形成質(zhì)粒-PEI復合物；將該復合物加入細胞密度為70%–80%的293T細胞培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集上清，用0.45 μm濾膜過濾病毒原液并超速離心獲得病毒濃縮液。

1.2.2 健康人外周血CAR-T細胞的制備及鑒定

利用外周血淋巴細胞分離液Ficoll提取健康人外周血中單個核細胞 (Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，按照T細胞與磁珠數(shù)量之比為1︰1加入α-CD3/α-CD28抗體包被的磁珠分離人T細胞，并置于含10%血清和100 μg/mL IL-2的AIM-V培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24 h后，計數(shù)活化的人CD3+T細胞，于每個孔加入0.1×106個T細胞和感染復數(shù) (Multiplicity of infection，MOI)=10的病毒濃縮液 (GPC3-BBZ或GPC3-BBZ-7×19)，培養(yǎng)基補齊至200 μL，并于每孔加入聚凝胺(1︰2 000)，1 200 r/min離心90 min，然后置于細胞培養(yǎng)箱中，4 h后換液。離心換液后繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2–3 d補充培養(yǎng)基或者傳代。制備的CAR-T細胞分別命名為GPC3-BBZ CAR-T細胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞，將未經(jīng)病毒感染的人T細胞 (non-CAR-T) 作為陰性對照。

取轉(zhuǎn)導5 d后的T細胞，用FACS (由50 mL PBS加1 mL胎牛血清配制而成) 洗滌細胞，離心棄上清液；加入100 μL FITC標記的人GPC3蛋白 (工作濃度為3 μg/mL) 重懸細胞，4 ℃孵育60 min，然后用FACS洗滌3次，用流式細胞儀檢測T細胞表面CAR的表達情況。

1.2.3 熒光素酶生物發(fā)光法檢測CAR-T細胞的體外殺傷活性

使用鼠抗人GPC3單克隆抗體和FITC標記的驢抗鼠IgG (H＋L) 抗體 (二抗) 對實驗室中4種肝癌細胞株Sk-hep1、HepG2、Huh7和Hep3B進行染色。用流式細胞術(shù)檢測其GPC3表達水平。將pLenti-T2A-Luc-GFP慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)導上述GPC3表達陽性的細胞，然后通過流式分選GFP陽性細胞，構(gòu)建長久、穩(wěn)定表達GFP和熒光素酶(Luciferase)，且表達率在90%以上的細胞株來用于后續(xù)的殺傷實驗。在96孔細胞培養(yǎng)板中加入0.01×106個靶細胞使其貼壁，并按效靶比2︰1、5︰1、10︰1和20︰1加入效應T細胞，每組設(shè)置3個復孔。另外再設(shè)置只加靶細胞與培養(yǎng)基的陰性對照孔和用ddH2O重懸靶細胞的陽性對照孔，每組3個復孔。靶細胞為人肝癌細胞HepG2、Huh7和Hep3B，效應細胞為non-CAR-T、GPC3-BBZ CAR-T細胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞，殺傷所用培養(yǎng)基為AIM-V T細胞完全培養(yǎng)基。鋪板結(jié)束后，將96孔板置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后在上清中加入熒光素酶的底物D-(-)-熒光素，避光孵育10 min, 使用酶標儀檢測熒光值，計算各組CAR-T細胞對腫瘤細胞的體外裂解率。裂解率=(Max-V)/(Max-Min)×100%。(Max：只加靶細胞與培養(yǎng)基孔的熒光值；Min：ddH2O重懸靶細胞孔的熒光值；V：效靶細胞共孵育孔測得的熒光值)

表1 質(zhì)粒構(gòu)建所需引物Table 1 Primer sequence for plasmid construction

1.2.4 ELISA法檢測CAR-T細胞分泌的IL-7和CCL19細胞因子水平

取培養(yǎng)至5 d和10 d的CAR-T細胞培養(yǎng)上清，300 r/min離心10 min后去除沉淀物，根據(jù)細胞因子檢測試劑盒要求，采用雙抗體夾心法檢測CAR-T細胞分泌的人IL-7 (Human IL-7) 和CCL19 (Human CCL19) 細胞因子水平，底物顯色后，使用酶標儀在450 nm讀取OD值，根據(jù)標準曲線計算各樣品中相應的細胞因子濃度。

1.2.5 CAR-T細胞活化水平檢測

將靶細胞與腫瘤細胞按1︰1的效靶比共孵育24 h，取上清300 r/min離心10 min后去除沉淀物，采用雙抗體夾心法檢測CAR-T細胞分泌人GM-CSF的水平。底物顯色后，使用酶標儀在450 nm讀取OD值，根據(jù)標準曲線計算各樣品中相應的細胞因子濃度。

采用同樣的方法將靶細胞與腫瘤細胞進行共孵育，并在上清中加入高爾基體阻斷劑 (美國BD公司)，6 h以后取T細胞進行染色：先洗滌T細胞，再用PE標記的抗人CD3抗體染色，方法同上，之后按照胞內(nèi)染色試劑盒的操作流程先固定和裂解T細胞，再加入配制的APC抗人IFN-γ抗體重懸T細胞，室溫孵育40 min，染色完成后用FACS洗滌細胞并用流式細胞儀檢測T細胞的IFN-γ分泌水平。

1.2.6 計數(shù)檢測CAR-T細胞增殖水平

將按相同MOI轉(zhuǎn)導病毒的GPC3-BBZ CAR-T細胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞鋪在96孔板中，0.1×106個/孔，每組設(shè)置3個復孔，并于3、5、7、9 d計數(shù)細胞的絕對數(shù)量，繪制生長曲線比較GPC3-BBZ CAR-T細胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞生長速度。

1.2.7 Transwell實驗檢測CAR-T細胞趨化功能

取培養(yǎng)至第5天的T細胞上清備用，取non-CAR-T細胞置于DynaMagTM-5磁力架上脫磁，1 500 r/min離心5 min，棄上清，將細胞用BufferⅠ (50 mL PBS中加入250 μL血清配制而成)洗滌后重懸，并計數(shù)，用5 μmol/L CFSE重懸(1×106個細胞加100 μL CFSE)，避光孵育10 min，然后用T細胞完全培養(yǎng)基洗滌3次。將transwell小室放到24孔板中，于下室中加入400 μL不同的CAR-T細胞培養(yǎng)上清，上室中加入CFSE標記的T細胞，0.2×106個/100 μL，然后將24孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 h后取出24孔板，熒光顯微鏡下拍照，并計數(shù)遷移到下室的T細胞數(shù)量。

1.2.8 流式細胞術(shù)檢測CAR-T細胞亞型分布

取培養(yǎng)第5天的CAR-T細胞，用流式細胞儀檢測其亞型分布情況，操作方法同上，使用抗體為APC抗人CD45RA抗體、FITC抗人CD45RO抗體、PB抗人CD62L抗體、生物素標記的F(ab′)2片段化羊抗人IgG和PE標記的鏈親和素(PE-SA)。

1.2.9 小鼠肝細胞癌腹腔移植瘤實驗檢測CAR-T細胞治療效果

收集處于生長對數(shù)期的Huh7-Luc-GFP細胞，接種于雄性NCG小鼠的腹腔，每只小鼠接種1×106個Huh7-Luc-GFP細胞。當腫瘤生長至第5天時，荷瘤小鼠被隨機分成2組，3只/組。各組小鼠通過尾靜脈分別注射相應數(shù)量的病毒感染9 d的CAR-T細胞：8×106個non-CAR-T細胞/只小鼠 (對照組)；8×106個GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞/只小鼠 (實驗組)。每隔5–7 d通過生物發(fā)光活體成像儀檢測小鼠體內(nèi)腫瘤生長情況和小鼠體重；CAR-T細胞注射后第28天采集小鼠外周血，通過流式細胞術(shù)檢測小鼠外周血CD3+T細胞和CAR-T細胞的生存情況。

1.2.10 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計學分析。所有實驗均獨立重復3次，結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用雙因素或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 成功構(gòu)建慢病毒載體GPC3-BBZ和GPC3-BBZ-7×19

如圖1所示，GPC3-BBZ載體的抗原識別片段來自針對GPC3的抗體4A11的單鏈可變區(qū)，其后連接人源的CD8α (鉸鏈區(qū)和跨膜段)、4-1BB(共刺激分子) 以及CD3ζ (T細胞活化基序)。GPC3-BBZ-7×19在GPC3-BBZ的基礎(chǔ)上加上人源IL-7和CCL19分子，中間用2A自剪切肽隔開。以上2個慢病毒載體構(gòu)建完成后，經(jīng)過AflⅡ限制性內(nèi)切酶鑒定以及上海桑尼生物科技有限公司測序，并與圖譜比對，結(jié)果與預期一致，說明構(gòu)建成功。

2.2 成功制備GPC3-BBZ CAR-T細胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞

成功構(gòu)建慢病毒載體質(zhì)粒后，將其與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞進行慢病毒包裝，獲得編碼GPC3-BBZ和GPC3-BBZ-7×19的慢病毒；然后以相同的感染復數(shù)轉(zhuǎn)導健康人外周血提取的CD3+T細胞，制備GPC3-BBZ CAR-T細胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞。培養(yǎng)第5天用FITC直接標記的商品化GPC3蛋白來檢測T細胞表面CAR的表達情況，結(jié)果顯示CAR成功表達于GPC3-BBZ CAR-T細胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞表面，且兩者之間無明顯差異 (P＞0.05，圖2A–B)，說明兩種CAR病毒對T細胞的感染能力相當。

2.3 GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞成功分泌IL-7和CCL19并在體外表現(xiàn)出增殖、趨化、亞型優(yōu)勢

使用不添加IL-7的AIM-V培養(yǎng)基對T細胞進行培養(yǎng)，并分別取第5天和第10天的T細胞培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測上清中IL-7和CCL19的濃度 (圖3A)。結(jié)果表明，non-CAR-T和GPC3-BBZ CAR-T細胞的培養(yǎng)上清中沒有檢測到這兩種細胞因子，而GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞的培養(yǎng)上清均檢測到IL-7和CCL19的分泌，并且隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，其濃度也有所上升，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.000 1)。因此可以進行下一步相關(guān)的功能驗證。

為比較兩種CAR-T細胞的增殖能力，我們將轉(zhuǎn)導GPC3-BBZ CAR或GPC3-BBZ-7×19 CAR病毒的T細胞以相同的數(shù)量鋪在96孔板中，然后隔天對T細胞進行計數(shù)。結(jié)果 (圖3B) 表明，從第7天開始，GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞的數(shù)量明顯多于GPC3-BBZ CAR-T細胞，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。培養(yǎng)第7天鏡下可見GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞成團生長，說明細胞狀態(tài)佳，且密度大于GPC3-BBZ CAR-T和Non-CAR-T細胞，說明分泌IL-7的第四代GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞其增殖能力優(yōu)于第二代。

圖1 慢病毒載體GPC3-BBZ和GPC3-BBZ-7×19的質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1 Design diagram of lentiviral vector GPC3-BBZ and GPC3-BBZ-7×19.GPC3-BBZ: the human GPC3-targeted second generation CAR lentiviral vector; GPC3-BBZ-7×19: the human GPC3-targeted fourth generation CAR lentiviral vector which can express human interleukin-7 and chemokine CCL19.

在趨化實驗中，我們將non-CAR-T細胞標記上CFSE染料，并通過熒光顯微鏡觀察GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞分泌至上清的CCL19對non-CAR-T細胞的趨化作用。結(jié)果 (圖3C) 表明，加入GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞培養(yǎng)上清的孔中，其遷移到下室的non-CAR-T數(shù)量比另兩個組更多，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.000 1)。

由于T細胞亞型對于CAR-T免疫治療效果具有重要作用，因此我們通過流式細胞術(shù)比較CAR-T細胞的亞型分布。結(jié)果 (圖3D) 表明，在GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞中，其初始T細胞(Native) (CAR+CD62L+CD45RA+CD45RO–) 和T記憶干細胞 (Tscm) (CAR+CD62L+CD45RA+CD45RO+)的比例高于GPC3-BBZ CAR-T，記憶干細胞的差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.001)。

2.4 GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞和GPC3-BBZ CAR-T細胞有相當?shù)募毎蜃臃置谀芰σ约绑w外殺傷毒性

用流式細胞術(shù)檢測實驗室的肝細胞癌細胞系SK-Hep1、Huh7、HepG2和Hep3B細胞表面GPC3的表達水平，結(jié)果如圖4A所示，Huh7表面的GPC3抗原為高表達，HepG2和Hep3B為中等表達，而SK-Hep1則不表達。

圖3 GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞和GPC3-BBZ CAR-T細胞體外功能比較Fig.3 Functional comparison of GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells and GPC3-BBZ CAR-T cells in vitro.(A) IL-7 and CCL19 secreted by GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells was detected on day 5 and 10 by ELISA.(B) Absolute numbers of GPC3-BBZ CAR-T and GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells on day 3, 5, 7, 9 counted.(C) Chemotactic capacity of CCL19 secreted by GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells toward non-CAR-T was examined by transwell assay.(D) To analysis the phenotype of CAR-T cells, the expression of CD62L, CD45RO, and CD45RA were determined by FCM assay with the indicated antibodies.Data represent the ±s of triplicates.*: P＜0.05, ***: P＜0.001, ****: P＜0.000 1, n=3.

將non-CAR-T細胞、GPC3-BBZ CAR-T細胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞與Huh7細胞按效靶比1︰1共孵育24 h，ELISA法檢測共孵育上清液中GM-CSF的濃度，流式胞內(nèi)染色法檢測共孵育T細胞IFN-γ的分泌情況。結(jié)果 (圖4B) 顯示，GPC3-BBZ CAR-T細胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞分泌GM-CSF和IFN-γ水平無顯著性差異(P＞0.05)。

在體外殺傷實驗中，我們采用熒光素酶生物發(fā)光法檢測CAR-T細胞與肝細胞癌細胞系(Huh7、HepG2和Hep3B) 在不同效靶比 (2︰1、5︰1、10︰1、20︰1) 下共孵育24 h后的體外殺傷情況。結(jié)果顯示，GPC3-BBZ CAR-T細胞和GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞均能夠特異性殺傷GPC3陽性腫瘤細胞，且殺傷效果無明顯差異(P值均＞0.05，圖4C)，其對于靶細胞的最大裂解率與靶細胞表面GPC3表達陽性率相關(guān)。以上結(jié)果表明，分泌IL-7和CCL19并沒有對CAR-T細胞活化后的細胞因子分泌能力以及殺傷的特異性和有效性造成不利影響。

圖4 GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞體外殺傷活性以及細胞因子分泌能力檢測Fig.4 Cytotoxicity and cytokine secretion detection of GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells in vitro.(A) The glypican-3(GPC3) expression on human hepatocellular carcinoma cell lines was detected by FCM assay.(B) GM-CSF and IFN-γ secretion of GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells co-cultured with GPC3 positive hepatocellular carcinoma cells were detected by ELISA and FCM assay.(C) Cytotoxicity of GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells in vitro was detected by luciferase bio-luminescence assay.GM-CSF: granulocyte-macrophage colony stimulating factor; IFN-γ: interferon-γ.Data represent the ±s of triplicates.***: P＜0.001, ****: P＜0.000 1, n=3.

2.5 GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞使小鼠體內(nèi)GPC3陽性的肝細胞癌腹腔移植瘤消退

首先建立Huh7-Luc-GFP細胞的腹腔移植瘤模型，然后利用GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞進行體內(nèi)治療。由生物發(fā)光成像結(jié)果 (圖5A) 來看，與non-CAR-T組相比，GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞有效使小鼠體內(nèi)的腫瘤消退。此外，我們將小鼠體重作為衡量CAR-T治療的毒性指標之一，定期對小鼠體質(zhì)量進行稱量。結(jié)果顯示，各組小鼠的體重無明顯差異 (P＞0.05，圖5B)，提示靶向GPC3的第四代CAR-T細胞 (分泌IL-7和CCL19)治療小鼠體內(nèi)的肝細胞癌腹腔移植瘤時未出現(xiàn)明顯的不良反應。

為了解CAR-T細胞在外周血中的存活情況，于28 d取小鼠外周血進行染色，通過流式檢測外周血中T細胞所占比率，結(jié)果表明CAR-T組小鼠CD3+T細胞占25% (圖5C–D)，這其中GPC3 CAR表達陽性的T細胞占50%，而對照組小鼠的外周血CD3+T細胞只占1%，這可能是由于實驗組小鼠體內(nèi)的腫瘤細胞被CAR-T特異性識別并刺激其增殖，而對照組中的non-CAR-T細胞不能特異性識別腫瘤細胞而自然衰竭死亡。

3 討論

基于CAR-T細胞的免疫過繼療法已被證明是治療B淋巴細胞惡性腫瘤的一項有效策略，目前這種臨床的成功性較難體現(xiàn)到實體瘤身上，由于實體瘤異質(zhì)性以及免疫微環(huán)境的存在，包括髓樣來源的抑制細胞 (Myeloid derived supressor cell，MDSC)、調(diào)節(jié)性T細胞 (Regulatory cell，Treg)、免疫抑制細胞因子 (例如IL-10) 等[25-26]，這些因素限制了CAR-T細胞在體內(nèi)的增殖能力和持久性，從而影響其抗腫瘤能力。

先前的研究表明，T區(qū)成纖維網(wǎng)狀細胞產(chǎn)生的IL-7和CCL19對于淋巴器官中T細胞區(qū)的形成和維持至關(guān)重要[27-28]。為了提高靶向GPC3的CAR-T細胞對肝細胞癌的治療效果，我們構(gòu)建并制備了靶向GPC3的第四代CAR-T細胞 (分泌IL-7和CCL19)，與第二代GPC3 CAR-T相比，IL-7和CCL19的分泌不影響T細胞表面CAR表達以及CAR-T殺傷肝癌細胞的特異性和有效性。然而在無外源性添加IL-7的培養(yǎng)過程中，GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞展現(xiàn)出了更為出色的增殖能力，這將有利于其在體內(nèi)的生存，提高其臨床活性。此外，CAR-T表型已被證明是臨床療效的一個關(guān)鍵因素[29-31]，相較于中央記憶型T細胞而言，T記憶干細胞分化程度低，具有更強的自我更新以及分化生成所有記憶和效應T細胞子集的能力，從而被認為具有更強的抗腫瘤活性和持久力[32]。已有研究表明IL-7趨向于誘導CAR-T細胞分化生成Naive、Tscm等分化程度更低的細胞[33]。經(jīng)亞型分析發(fā)現(xiàn)，GPC3-BBZ-7×19 CAR-T中Tscm的比率確實高于二代GPC3-BBZ CAR-T，這有利于其在體內(nèi)形成針對腫瘤的長效記憶功能，從而更有效預防腫瘤復發(fā)。CCL19是T細胞和樹突狀細胞的趨化因子，我們于體外驗證GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞分泌的CCL19對non-CAR-T細胞具有促遷移作用，這有助于其在體內(nèi)募集外周血T細胞和樹突狀細胞協(xié)同對抗腫瘤。此外針對HCC移植瘤模型的體內(nèi)研究表明，GPC3-BBZ-7×19 CAR-T能有效清除免疫缺陷小鼠體內(nèi)的HCC移植瘤模型，并且在觀察期間小鼠體重穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)不良反應，一個月之后在外周血中仍然能夠檢測到部分存活的CAR-T細胞。

傳統(tǒng)的CAR-T細胞由于在體內(nèi)生存時間不夠長，而且受到腫瘤微環(huán)境中各種免疫抑制因子的影響，對腫瘤的浸潤能力較差，本研究構(gòu)建了一種靶向GPC3的第四代CAR-T細胞 (分泌IL-7和CCL19)，其生存能力、趨化能力和亞型分布均優(yōu)于第二代GPC3 CAR-T細胞，因此有望在體內(nèi)取得更好的抗腫瘤效果，并為之后的臨床試驗提供臨床前研究基礎(chǔ)。

圖5 GPC3-BBZ-7×19 CAR-T細胞對NCG小鼠體內(nèi)肝細胞癌腹腔移植瘤的作用效果Fig.5 Effect of GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells on the growth of GPC3-positive hepatocellular carcinoma xenograft in NCG mice.(A) NCG mice bearing Huh-7-Luc-GFP xenografts were intravenous injected with 8×106 non-CAR-T or GPC3-BBZ-7×19 CAR-T cells on day 5.Mice were imaged weekly.Tumor growth was assessed by total bioluminescence signals.(B) The weight curve of NCG mice after incubation with different CAR-T cells.(C) CD3+ human T cells in mice peripheral blood were detected by FCM assay.(D) CAR+ T cells in mice peripheral blood were detected by FCM assay.