張婷，李劍芳，胡蝶,，李闖，胡博淳，鄔敏辰

1 江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122

2 江南大學 無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫 214122

3 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122

苯乳酸 (Phenyllactic acid，PLA) 是一種高附加值的天然有機酸，具有廣譜抑菌性，可代替防腐劑應用于食品和飼料中[1]。L-PLA和D-PLA是苯乳酸的兩種對映異構體[2]，它們具有不同的應用價值，D-PLA可用于合成降血糖藥物恩格列酮和驅腸蟲藥PF1022A，而L-PLA可用于合成非蛋白氨基酸Statine和新型生物可降解材料聚苯乳酸[3-5]。生物酶法合成光學純PLA具有反應條件溫和、光學純度高及環(huán)境友好等優(yōu)點而備受青睞[6]。

乳酸脫氫酶 (Lactate dehydrogenase，LDH) 分為L-LDH (EC.1.1.1.27) 和D-LDH (EC.1.1.1.28)，是以輔酶NADH或NAD+作為氫傳遞[7]，在生物體內催化丙酮酸與乳酸之間的還原與氧化反應[8]。LDH能夠不對稱還原潛手性α-酮酸生成α-羥基酸，具有較廣的底物譜，對天然底物丙酮酸具有較高酶活力，而對非天然底物苯丙酮酸 (Phenylpyruvate，PPA) 的酶活力較低。如來源于植物乳桿菌Lactobacillus plantarum的L-LpLDH[9]、L-LpLDH1和L-LpLDH2[10]、巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium的L-BmLDH[11]、嗜熱脂肪土芽孢桿菌Geobacillus stearothermophilus的L-BsLDH[12]和凝結芽孢桿菌B.coagulans的L-BcLDH[6,13]催化PPA的比活力分別為28.1、71.1、0.1、3.4、7.4和72.6 U/mg；來源于L.plantarum的D-LpLDH[10]、菊糖芽孢乳桿菌Sporolactobacillus inulinus的D-SiLDH[14]、乳酸片球菌Pediococcus acidilactici的D-PaLDH[15]和戊糖片球菌P.pentosaceus的D-PpLDH[16]催化PPA的比活力分別為215.8、4.3、140.0 和116.0 U/mg。

目前，采用微生物發(fā)酵法制備非光學純PLA的PPA轉化率及PLA產(chǎn)率均較低[17]。多種來源L-LDH和D-LDH在大腸桿菌Escherichia coli表達，并分別應用于制備光學純L-PLA和D-PLA。Wang等[14]利用表達D-SiLDHM307L的E.coli全細胞，采用體內輔酶循環(huán)體系催化158.2 mmol/L PPA制備D-PLA (eep＞99.7%) 的產(chǎn)率為82.3%；Zhu等[9]將L-LpLDH與葡萄糖脫氫酶 (Glucose 1-dehydrogenase，GDH) 在E.coli中共表達，全細胞催化186.2 mmol/L PPA的轉化率為89.2%，L-PLA (eep=99.7%) 產(chǎn)率僅為55.7%。Zhu等[9,18]研究表明，E.coli全細胞自身代謝酶在催化PPA過程中產(chǎn)生副產(chǎn)物，如圖1所示，轉氨酶可將PPA轉化為苯丙氨酸 (Phe)，且葡萄糖參與細胞新陳代謝生成乳酸，造成PLA產(chǎn)率低且分離困難。巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris本身不分泌內源蛋白，外源蛋白可通過信號序列進行胞外分泌表達。近年，來源于腸系膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides的D-LmLDH[19]和L.plantarumD-LpLDHY52L突變體[20]在P.pastoris胞內表達，分別利用重組P.pastoris全細胞生成D-乳酸和(R)-2-羥基-4-苯基丁酸。

本研究室前期從干酪乳桿菌Lactobacillus caseiCICIM B1192基因組中克隆出一種編碼LLDH的基因lcldh1(GenBank登錄號CAP07851)，并實現(xiàn)其在E.coli中表達[21]，通過定點和迭代飽和突變構建L-LcLDH1Q88A/I229A突變體，顯著提高其催化PPA的酶活力。為避免副產(chǎn)物形成，提高L-PLA產(chǎn)率，本研究利用P.pastorisGS115分泌表達L-LcLDH1Q88A/I229A突變體，并與嗜酸熱源體Thermoplasma aciddophilium葡萄糖脫氫酶SyGDH構建體外輔酶NADH循環(huán)體系，通過進一步優(yōu)化reLcLDH01Q88A/I229A和SyGDH雙酶偶聯(lián)不對稱還原PPA的催化條件，實現(xiàn)高效制備L-PLA。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組菌E.coli/pET-22b-lcldh1、E.coli/pET-22b-lcldh1Q88A/I229A、E.coli/pET-22b和E.coli/pET-28a-sygdh，表達宿主E.coliJM109和P.pastorisGS115和表達質粒pPIC9K均由實驗室保藏；克隆載體pUCm-T購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；T4 DNA連接酶、內切酶EcoRⅠ、NotⅠ和SalⅠ，購自大連TaKaRa公司；質粒提取試劑盒和ESTaqMaster Mixture購自江蘇康為世紀公司；苯丙酮酸鈉、D-/L-苯乳酸和苯丙氨酸均購于美國Sigma-Aldrich公司；還原型輔酶ⅠNADH和氧化型輔酶ⅠNAD+購自上海阿拉丁公司。

1.2 方法

1.2.1 重組表達質粒的構建

根據(jù)乳酸脫氫酶L-LcLDH1基因及酵母表達載體pPIC9K多克隆位點，設計上游和下游引物(L9K-F：5′-CTCGAG AAAAGAGTGGCAAGTATT ACGG-3′；L9K-R：5′-GCGGCCGC CTAGTGGTGG TGGTGGTGGTGCTGACGAGTTTCGATG-3′)，酶切位點為EcoRⅠ和NotⅠ(下劃線表示)，并委托生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

圖1 LDH和GDH雙酶共表達大腸桿菌全細胞不對稱還原PPA制備PLA[9,18]Fig.1 Asymmetric reduction of PPA to PLA by co-expressing LDH and GDH in E.coli cells[9,18].

以重組質粒pET-22b-lcldh1或pET-28alcldh1Q88A/I229A為模板，L9K-F和L9K-R為引物，通過PCR擴增出目的基因 (lcldh1和lcldh1Q88A/I229A)，與pUCm-T載體連接構建克隆質粒pUCm-T-lcldh1和pUCm-T-lcldh1Q88A/I229A，經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切的克隆質粒與經(jīng)同樣雙酶切的pPIC9K連接后，轉化E.coliJM109，構建重組菌JM109/pPIC9K-lcldh1和JM109/pPIC9K-lcldh1Q88A/I229A。

1.2.2 重組畢赤酵母轉化子的篩選和表達

提取pPIC9K、pPIC9K-lcldh1和pPIC9Klcldh1Q88A/I229A質粒，經(jīng)SalⅠ線性化后，電轉化P.pastorisGS115感受態(tài)細胞，構建重組P.pastoris菌GS115/lcldh1和GS115/lcldh1Q88A/I229A。參照Multi-CopyPichiaExpression Kit操作手冊，補料添加1% (V/V) 的甲醇在30 ℃誘導培養(yǎng)72 h，收集發(fā)酵液，以經(jīng)同樣條件誘導的GS115/pPIC9K作為陰性對照，SDS-PAGE分析重組酶表達。

1.2.3 酶活力的測定及檢測方法

LDH酶活力測定：1 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液(50 mmol/L，pH 5.5)，加入10 mmol/L PPA，2 mmol/L NADH，混勻后35 ℃保溫5 min，加入適量酶液反應5 min，加入2 mL甲醇終止反應，采用反相HPLC色譜分析PLA生成量。在上述條件下，每分鐘生成1 μmol的PLA定義為1個LDH活力單位 (U)。GDH酶活力測定參照文獻報道[22]，反應溫度和pH修改為35 ℃和5.5。

反相HPLC分析方法：采用HPLC為Waters e2695系統(tǒng)，二極管陣列 (PDA) 檢測器和ProntoSIL C18 AQ (4.6 mm×250 mm，5 μm) 色譜柱進行樣品分析。檢測條件為：流動相為水/甲醇(62︰38，V/V，含0.05%三氟乙酸)，流速1.0 mL/min，進樣量為10 μL，色譜柱溫度為30 ℃，檢測波長210 nm。Phe、PPA和PLA的保留時間分別是4.52、9.23和10.9 min。

正相HPLC分析方法：采用Daicel OD-H(4.6 mm×250 mm，5 μm) 色譜柱分析PLA的光學純度。檢測條件為：流動相為正己烷/異丙醇 (98︰2，V/V，含0.05%三氟乙酸)，其他條件與反相HPLC相同。D-PLA和L-PLA的保留時間分別是25.7和28.1 min。L-PLA的對映體過量值 (eep) 計算公式為：

式中：AL和AD分別表示L-PLA和D-PLA的峰面積。

1.2.4 輔酶NADH循環(huán)體系的構建和驗證

重組葡萄糖脫氫酶SyGDH (GenBank登錄號AL445065) 的誘導表達及純化參考文獻報道[22]，純化SyGDH后經(jīng)冷凍干燥制得SyGDH酶粉。構建不同輔酶NADH循環(huán)體系 (表1)，催化體系中參數(shù)分別為50 mmol/L醋酸鈉緩沖液 (pH 5.5)，10 mmol/L PPA，2 mmol/L NADH或NAD+，15 mmol/L葡萄糖，0.2 U/mL reLcLDH1Q88A/I229A和0.2 U/mLSyGDH；以E.coli/lcldh1Q88A/I229A全細胞催化作對照，反應體系中包含50 mmol/L醋酸鈉緩沖液 (pH 6.0)，10 mmol/L PPA，15 mmol/L葡萄糖和50 mg/mLE.coli/LcLDH1Q88A/I229A濕菌體，反應條件均為35 ℃、220 r/min反應2 h，按照1.2.3反相HPLC色譜測定L-PLA的產(chǎn)量。

1.2.5 雙酶偶聯(lián)不對稱還原苯丙酮酸催化條件的優(yōu)化

溫度和pH對催化反應的影響：構建包含10 mmol/L PPA、0.5 mmol/L NAD+、20 mmol/L葡萄糖、0.2 U/mL reLcLDH1Q88A/I229A和0.2 U/mL SyGDH的催化體系，分別在不同反應溫度 (20–60℃)和pH 5.5緩沖液或者不同pH (3.5–7.0) 緩沖液和40 ℃條件下進行催化反應，反應20 min后測定L-PLA的產(chǎn)量。

PPA濃度對催化反應的影響：構建包含不同底物濃度PPA (20–300 mmol/L)、葡萄糖濃度為PPA 1.5倍、2.5 mmol/L NAD+、15 U/mL reLcLDH1Q88A/I229A和1 U/mL SyGDH的催化體系，在40 ℃和pH 5.0條件下反應不同時間取樣，測定L-PLA的產(chǎn)量。

酶添加量對催化反應的影響：構建包含100 mmol/L PPA、150 mmol/L葡萄糖、2.5 mmol/L的NAD+、不同酶量 (0.5–15 U/mL) reLcLDH1Q88A/I229A和1 U/mL SyGDH的催化體系，在40 ℃和pH 5.0條件下反應2 h后，分別測定L-PLA的產(chǎn)量。

NAD+濃度對催化反應的影響：構建包含100 mmol/L PPA、150 mmol/L葡萄糖、不同濃度(0.2–2.5 mmol/L) 的NAD+，10 U/mL的reLcLDH1Q88A/I229A和1 U/mLSyGDH的催化體系，在40 ℃和pH 5.0條件下反應2 h后，分別測定L-PLA的產(chǎn)量。

葡萄糖濃度對催化反應的影響：構建包含100 mmol/L PPA，不同濃度 (80–200 mmol/L) 葡萄糖，2.0 mmol/L NAD+，10 U/mL reLcLDH1Q88A/I229A和1 U/mLSyGDH的催化體系，在40 ℃和pH 5.0條件下反應2 h后，分別測定L-PLA的產(chǎn)量。

1.2.6 雙酶偶聯(lián)不對稱還原苯丙酮酸的反應進程

在25 mL雙酶偶聯(lián)催化體系，包含50 mmol/L醋酸-醋酸鈉 (pH 5.0)、100 mmol/L PPA、120 mmol/L葡萄糖，2.0 mmol/L NAD+、10 U/mL reLcLDH1Q88A/I229A和1 U/mLSyGDH的催化體系，在40 ℃、220 r/min條件下反應不同時間取樣，按照1.2.3反相HPLC測定PPA的轉化率和L-PLA的產(chǎn)量，正相HPLC檢測L-PLA的對映體過量值，并計算出時空產(chǎn)率(Space time yield，STY) 和平均轉化率 (Average turnover frequency，aTOF)，其計算公式為：

式中：cp為L-PLA的產(chǎn)量 (g/L)，t為反應時間 (h)，ce為酶蛋白添加量 (g/L)。

2 結果與分析

2.1 重組畢赤酵母的構建及表達

重組酵母GS115/lcldh1和GS115/lcldh1Q88A/I229A經(jīng)甲醇誘導收集發(fā)酵液，SDS-PAGE分析表明reLcLDH1和reLcLDH1Q88A/I229均在約36.8 kDa處有明顯特異性條帶，與E.coli/lcldh1Q88A/I229A表達reLcLDH1Q88A/I229的目的條帶大小一致 (圖2)。以PPA為底物，reLcLDH1和reLcLDH1Q88A/I229A的比活力分別為6.3 U/mg和270.5 U/mg，reLcLDH1Q88A/I229比活力明顯高于其他來源天然L-LDH[6,9-12]。Aslan等[12]通過半理性設計獲得最優(yōu)突變酶L-BsLDHN101D/Q102Y催化PPA比活力僅從7.4 U/mg提高至51.3 U/mg。

2.2 輔酶NADH循環(huán)體系的構建及驗證

重組葡萄糖脫氫酶SyGDH具有較強的耐酸和適酸性，以及熱穩(wěn)定性[22]，通過構建reLcLDH1Q88A/I229A和SyGDH不同的雙酶偶聯(lián)體系，驗證輔酶NADH循環(huán)再生的可行性。如表1所示，催化體系1、2、3和4說明SyGDH在以葡萄糖作為底物實現(xiàn)了NADH輔酶循環(huán)再生，在未同時添加SyGDH和葡萄糖的體系2和4中，PLA產(chǎn)率決于NADH的添加量；催化體系4和6表明添加NAD+與NADH均能實現(xiàn)輔酶循環(huán)，產(chǎn)物L-PLA產(chǎn)率高達99.9%(圖3A，3C)，其eep＞99.9% (圖3D–E)，故選擇價格較低的NAD+作為輔酶。對比7和8表明，E.coli/lcldh1Q88A/I229A全細胞作為催化劑時，不需要額外添加輔酶，但PLA產(chǎn)率僅為89.1%，其副產(chǎn)物的出峰時間與苯丙氨酸一致 (圖3B)。全細胞含有各種酶系，無額外添加輔酶也可完成輔酶NADH的循環(huán)再生，但往往再生效率較低。與此同時，E.coli代謝途徑轉氨反應中的氨基酸轉移酶，可將一部分PPA進行轉氨形成苯丙氨酸[23]。Zhu等[9]也在研究中提到，其用E.coli/pETduet-lpldh催化時有將近30%的PPA被用于其他代謝途徑，這導致PPA的轉化效率和PLA的產(chǎn)率均不高。

圖2 重組酶LcLDH1 and LcLDH1Q88A/I229A的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant LcLDH1 and LcLDH1Q88A/I229A.M: protein marker; 1: the cultured supernatant of GS115/pPIC9K; 2: the cultured supernatant of GS115/lcldh1; 3: the cultured supernatant of GS115/lcldh1Q88A/I229A; 4: the whole cells of E.coli/pET-22b; 5: the whole cells of E.coli/lcldh1Q88A/I229A.

表1 不同催化體系驗證體外輔酶NADH循環(huán)的構建Table 1 Verification of NADH regeneration in vitro in the different reaction systems

圖3 HPLC分析重組L-LcLDH1Q88A/I229A催化不對稱還原PPAFig.3 HPLC analysis of the asymmetric reduction of PPA catalyzed by recombinant L-LcLDH1Q88A/I229A.(A) Phe, PPA and PLA standard samples.(B) E.coli whole cells catalyzed PPA.(C, E) reLcLDH1Q88A/I229A catalyzed PPA coupling with SyGDH.(D) Racemic PLA standard samples.

2.3 雙酶偶聯(lián)不對稱還原苯丙酮酸的催化條件優(yōu)化

2.3.1 溫度和pH對催化反應的影響

酶促反應效率與溫度和pH有關。如圖4A 所示，L-PLA的產(chǎn)量隨反應溫度的升高而升高，且在40 ℃時達到最高值。如圖4B所示，L-PLA產(chǎn)量在pH為5.0時達到最高，當pH＞5.0后，隨著pH的增高，產(chǎn)量明顯降低，pH到達7.0時，產(chǎn)量為零，表明溫度和pH對催化反應具有重要影響，雙酶偶聯(lián)催化反應的最適溫度和pH為40 ℃和5.0，與reLcLDH1Q88A/I229A的最適反應溫度和pH一致。由于SyGDH具有良好的溫度和pH穩(wěn)定性，而溫度和pH對reLcLDH1Q88A/I229A的影響較大，故雙酶偶聯(lián)體系中催化生成L-PLA依賴于reLcLDH1Q88A/I229A。

2.3.2 PPA濃度對催化反應的影響

為提高PPA的生產(chǎn)效率，構建reLcLDH1Q88A/I229A和SyGDH體外雙酶偶聯(lián)體系催化不同濃度的PPA。如表2所示，10、50和100 mmol/L的PPA在2 h內完全水解，L-PLA的產(chǎn)率均大于99%，時空產(chǎn)率 (STY) 從1.64 g/(L·h) 提高至8.2 g/(L·h)；當PPA濃度為150 mmol/L時，L-PLA的產(chǎn)量為104.1 mmol/L，而產(chǎn)率僅為69.4%，由于隨著L-PLA濃度增加，SyGDH催化葡萄糖產(chǎn)生等量葡萄糖酸，測定催化體系中pH值從5.0降至3.0，導致reLcLDH1Q88A/I229A和SyGDH酶活力顯著降低，從而不能繼續(xù)轉化PPA。此外，當PPA濃度大于150 mmol/L時，L-PLA的產(chǎn)量隨著PPA濃度的增加而降低，當?shù)孜餄舛葹?00 mmol/L時，L-PLA的產(chǎn)量僅為9.6 mmol/L，表明存在底物抑制作用。據(jù)文獻報道，由于高濃度PPA對LDH的催化具有抑制作用，采用補料添加PPA的手段可以顯著增加PLA的產(chǎn)量[9,24-25]。Zheng等[6]研究表明，L-BcLDH催化PPA抑制濃度為90 mmol/L，Zhu等[9]研究中指出L-LpLDH催化80 mmol/L PPA的轉化效率最佳。

圖4 不同溫度、pH值下雙酶偶聯(lián)體系催化不對稱還原PPAFig.4 Asymmetric reduction of PPA at different temperatures (A) and pH values (B) in double-enzyme system.

表2 雙酶偶聯(lián)體系不對稱還原不同濃度的PPATable 2 Asymmetric reduction of PPA at different concentrations in double-enzyme system

2.3.3 酶添加量、NAD+濃度和葡萄糖濃度對催化反應的影響

為進一步提高其生產(chǎn)效率，對酶添加量、NAD+濃度和葡萄糖濃度進行優(yōu)化。如圖5所示，隨著reLcLDH1Q88A/I229A添加量的增大，L-PLA的產(chǎn)率逐漸增加，當達到10 U/mL時，L-PLA產(chǎn)率可達99.9%；當NAD+添加量為2.0 mmol/L時，L-PLA產(chǎn)量達到最高；葡萄糖濃度超過120 mmol/L后L-PLA產(chǎn)量稍微降低。與初始反應體系相比，reLcLDH1Q88A/I229A酶添加量、NAD+濃度和葡萄糖濃度分別降低至10 U/mL、2.0和120 mmol/L以提高其利用率。

圖5 雙酶偶聯(lián)不對稱還原PPA催化條件的優(yōu)化Fig.5 Optimization of the catalytic conditions for the asymmetric reduction of PPA in double-enzyme system.

2.4 雙酶偶聯(lián)不對稱還原苯丙酮酸

以優(yōu)化的催化條件下，擴大雙酶偶聯(lián)反應體系至25 mL，檢測不對稱還原100 mmol/L PPA制備L-PLA的反應進程。如圖6所示，反應105 min后，PPA的轉化率＞99.9%，L-PLA的產(chǎn)率可達到99.8%，eep＞99.9%，平均轉化率aTOF為257.0 g/(g·h)，時空產(chǎn)率為9.5 g/(L·h)。與其他不同來源的LDH不對稱還原PPA制備PLA的比較如表3所示，盡管L-LpLDH與GDH雙酶共表達E.coli全細胞催化PPA生成L-PLA具有較高時空產(chǎn)率，但其L-PLA的產(chǎn)率僅為55.8%；Xu等[26]利用來源于乳桿菌Lactobacillussp.CGMCC 9967的苯丙酮酸還原酶LaPPR與GDH雙酶共表達E.coli全細胞 (20 g干細胞) 催化PPA生成D-PLA濃度高達550.0 mmol/L，產(chǎn)率為91.3%，由于較低的催化活力，其aTOF僅為0.5 g/(g·h)。與已有報道相比，reLcLDH1Q88A/I229A和SyGDH體外雙酶偶聯(lián)催化不對稱還原PPA具有更高的產(chǎn)率和生產(chǎn)效率。

圖6 reLcLDH1Q88A/I229A不對稱還原PPA產(chǎn)L-PLA的進程曲線Fig.6 Time course of the production of L-PLA from PPA by reLcLDH1Q88A/I229A.

表3 比較不同來源LDH不對稱還原PPA制備PLATable 3 Comparison of asymmetric reduction of PPA to prepare PLA by LDH

3 結論

微生物發(fā)酵和酶催化是生物催化法合成PLA的兩種重要途徑。微生物發(fā)酵法由于底物轉化率低、反應時間長和無法獲得光學純PLA，而不能滿足實際生產(chǎn)。L-乳酸脫氫酶是酶催化生產(chǎn)L-PLA的關鍵酶，但目前已報道的L-乳酸脫氫酶的酶活力較低，且大多以大腸桿菌表達宿主，存在生成副產(chǎn)物、產(chǎn)率較低和生產(chǎn)效率低等缺點。本研究將突變酶L-LcLDH1Q88A/I229A在畢赤酵母中分泌表達，重組L-LcLDH1Q88A/I229A具有高酶活力；構建reLcLDH1Q88A/I229A與SyGDH的體外輔酶NADH再生的雙酶偶聯(lián)體系不對稱還原PPA，并通過優(yōu)化雙酶偶聯(lián)催化體系顯著提高了底物PPA濃度和L-PLA的生產(chǎn)效率。本研究構建的重組L-乳酸脫氫酶突變體的體外輔酶循環(huán)體系，在不對稱還原PPA中具有高催化活力、不產(chǎn)生副產(chǎn)物、高光學純度和高生產(chǎn)效率等優(yōu)點，使其具有較好的工業(yè)應用前景。