楊絨娟 李朋朋 周德剛

摘要?通過(guò)設(shè)計(jì)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)馬腺疫鏈球菌獸疫亞種及多殺性巴氏桿菌的定量、定性殺滅試驗(yàn)，對(duì)該消毒劑的消毒效果進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉1 600倍稀釋時(shí)對(duì)馬腺疫鏈球菌獸疫亞種的殺菌率為100%;3 200倍稀釋時(shí)對(duì)多殺性巴氏桿菌殺菌率為100%。過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)馬腺疫鏈球菌獸疫亞種的最低有效濃度為3 200倍稀釋，該濃度的最短作用時(shí)間為60 min;對(duì)多殺性巴氏桿菌的最低有效濃度為3 200倍稀釋，該濃度的最短作用時(shí)間為30 min。

關(guān)鍵詞?過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉;細(xì)菌定量試驗(yàn);細(xì)菌定性試驗(yàn)

中圖分類號(hào)?S859.79+9.1?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A?文章編號(hào)?0517-6611（2020）14-0085-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.023

Abstract?The disinfection effect of the disinfectant was studied by observing the quantitative and qualitative killing test of potassium monopersulfate triple salt?composite powder on?Streptococcus equi?subsp.?zooepidemicus?and?Pasteurella multocida?. The results showed that the bactericidal rate of potassium monopersulfate triple salt composite?powder to?S.equi?subsp.?zooepidemicus?was 100% at 1 600 times dilution and to?P.multocida?was 100% at 3 200 times dilution. The minimum effective concentration of potassium monopersulfate triple salt?composite?powder to?S.equi?subsp.?zooepidemicus?was 3 200 times of dilution， and the shortest action time of this concentration was 60 min; the minimum effective concentration to?P.multocida?was 3 200 times of dilution， and the shortest action time of this concentration was 30 min.

Key words?Potassium monopersulfate triple salt composite powder;Bacterial quantitative test;Bacterial qualitative test

動(dòng)物性疫病是影響當(dāng)代養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素，我國(guó)提倡“預(yù)防為主，防治結(jié)合”的方針政策，使用消毒劑對(duì)畜舍及其周圍環(huán)境消毒是預(yù)防疫病必不可少的措施[1]。過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉是由過(guò)硫酸氫鉀KHSO5（PMS）、硫酸氫鉀KHSO4和硫酸鉀K2SO4這3種物質(zhì)組成，KHSO5為其主要成分，具有強(qiáng)氧化性，易溶于水[2]，殺菌原理主要是利用單過(guò)硫酸氫鉀的特殊氧化能力和鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即在水中不斷產(chǎn)生新生態(tài)氧、次氯酸、自由羥基、過(guò)氧化氫，通過(guò)新生態(tài)氧和自由羥基的氧化作用可以改變細(xì)胞膜的通透性使之破裂，從而達(dá)到殺滅病原微生物的目的[3]。過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉作為一種廣譜、高效、低毒的獸用復(fù)方消毒劑被廣泛關(guān)注[4]。為觀察驗(yàn)證過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉的消毒效果，筆者擬研究過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)馬腺疫鏈球菌獸疫亞種及多殺性巴氏桿菌的消毒效果。

1?材料與方法

1.1?試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂，購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;小牛血清，購(gòu)自鄭州益康生物有限公司;硫代硫酸鈉（五水），分析純，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠;無(wú)水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合鹽，購(gòu)自上海安爾信化學(xué)有限公司。

磷酸鹽緩沖液（PBS，0.03 mol/L）：無(wú)水磷酸氫二鈉2.83 g，磷酸二氫鉀1.36 g，純化水加至1 000 mL，待完全溶解后，于121 ℃高壓滅菌20 min。

中和劑（0.5%硫代硫酸鈉）：硫代硫酸鈉2 g，純化水加至400 mL，待完全溶解后，于121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2?主要儀器設(shè)備

JA2003電子天平（上海上平儀器有限公司）;NU-425-400S生物安全柜（美國(guó)Nuaire）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）;全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;核酸蛋白測(cè)定儀（德國(guó)Eppendorf公司）;微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司）;渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）。

1.3?菌株

大腸桿菌8099、馬腺疫鏈球菌獸疫亞種CVCC556、多殺性巴氏桿菌CVCC399，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4?藥品

以過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合鹽為主成分，氨基磺酸、蘋果酸、氯化鈉、十二烷基苯磺酸鈉、六偏磷酸鈉等為輔料，參照專利US4822512[5]制得過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑。

1.5?方法

1.5.1?菌懸液的制備。

取出菌種凍干粉，用接種環(huán)蘸取少量干粉在培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)20 h（第一代）。從生長(zhǎng)良好的平板上挑取單個(gè)菌落，在培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)20 h（第二代）。從傳代后的平皿上挑取4～10個(gè)典型菌落至PBS中，取部分菌懸液用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定OD600，將剩余菌懸液的OD600調(diào)整至0.14～0.18，按此比例調(diào)整剩余菌液，混合均勻后進(jìn)行倍比稀釋，將上述菌懸液用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行多次細(xì)菌計(jì)數(shù)。摸索細(xì)菌含量符合《獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范》[6]第三、四章中規(guī)定的調(diào)整方法，按照此方法制備菌懸液作為工作菌液進(jìn)行試驗(yàn)，菌懸液現(xiàn)用現(xiàn)配，不得過(guò)夜使用。

1.5.2?中和劑的選擇。

用0.5%的硫代硫酸鈉溶液作為中和劑，以大腸桿菌作為指示菌進(jìn)行試驗(yàn)，用無(wú)菌純化水稀釋消毒劑。

試驗(yàn)分組如下：

第1組，消毒劑+菌懸液，證明消毒劑在試驗(yàn)濃度下是否有殺菌或抑菌作用。0.5 mL消毒劑與4.5 mL工作菌液混勻作用5 min，吸取0.5 mL作用液與4.5 mL PBS混勻，吸取0.1 mL最終樣液接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿。

第2組，（消毒劑+菌懸液）+中和劑，證明中和劑能否中和殘留消毒劑的抑菌作用。0.5 mL消毒劑與4.5 mL工作菌液混勻作用5 min，吸取0.5 mL作用液與4.5 mL中和劑混勻作用10 min，吸取0.1 mL中和產(chǎn)物原液接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿。

第3組，中和劑+菌懸液，證明中和劑是否抑菌。0.5 mL工作菌液和4.5 mL純化水混勻作用5 min，吸取0.5 mL作用液與4.5 mL中和劑混勻作用10 min，最終樣液用PBS進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-2、10-3接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿。

第4組，（消毒劑+中和劑）+菌液，證明消毒劑與中和劑的反應(yīng)產(chǎn)物有無(wú)抑菌作用。0.5 mL消毒劑和4.5 mL中和劑混勻作用10 min，吸取4.5 mL作用液與0.5 mL工作菌液混勻作用5 min，最終樣液用PBS進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-2、10-3接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿。

第5組，稀釋液（PBS）+菌懸液，作為陽(yáng)性對(duì)照，證明菌種與培養(yǎng)基是否合適。取0.5 mL菌懸液與4.5 mL純化水混勻，吸取0.5 mL混合液與4.5 mL PBS混勻，最終樣液用PBS進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-2、10-3接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿。

第6組，稀釋液（PBS）、中和劑、未接種培養(yǎng)基，作為陰性對(duì)照，證明培養(yǎng)基及試劑是否污染。分別吸取稀釋液（PBS）、中和劑0.1 mL接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿。

將上述培養(yǎng)皿置于37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)20 h，觀察結(jié)果。

1.5.3?過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)微生物的定量殺滅試驗(yàn)。

用無(wú)菌純化水按不同稀釋倍數(shù)溶解并稀釋過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉作為供試消毒劑。吸取0.5 mL工作菌液于各供試消毒劑中作用5 min，取作用液0.5 mL于4.5 mL中和劑作用10 min。以PBS代替消毒劑，同時(shí)進(jìn)行上述步驟，作為陽(yáng)性對(duì)照組，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組。最終樣液用PBS 10倍系列稀釋，于含10%血清的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。當(dāng)消毒劑最高稀釋倍數(shù)的殺菌率均在99.9%以上時(shí)，可判定該稀釋倍數(shù)為消毒劑的有效殺菌濃度。該試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，以3次試驗(yàn)殺菌率的平均值表示最終殺菌率。

殺菌率（?Pt）=（N0-Nt）/N0×100%，其中N0=對(duì)照組的活菌數(shù)，Nt?=試驗(yàn)組的活菌數(shù)。

1.5.4?過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)微生物的定性殺滅試驗(yàn)。

用無(wú)菌純化水按不同稀釋倍數(shù)溶解并稀釋過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉作為供試消毒劑。取稀釋好的工作菌液2.5 mL加入到2.5 mL供試消毒劑中，計(jì)時(shí)5、10、15、30、60 min，分別取0.5 mL作用液加入4.5 mL中和劑作用10 min。取0.5 mL終樣液加入4.5 mL含10%血清的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察結(jié)果。以PBS代替消毒劑，其他操作同上述步驟，作為陽(yáng)性對(duì)照組，同時(shí)設(shè)培養(yǎng)基對(duì)照（P），每種菌的定性試驗(yàn)均重復(fù)3次。培養(yǎng)物發(fā)生渾濁即表示有細(xì)菌生長(zhǎng)，若不變渾濁，繼續(xù)培養(yǎng)至第7天，若仍不渾濁方可判為無(wú)菌生長(zhǎng)。以無(wú)菌生長(zhǎng)管消毒劑的最低濃度為最低殺菌有效濃度，以無(wú)菌生長(zhǎng)管的最短消毒時(shí)間為該濃度殺菌最快有效時(shí)間。

2?結(jié)果與分析

2.1?菌懸液制備條件摸索結(jié)果

中和劑工作菌液：大腸桿菌8099調(diào)至OD600為0.14，再進(jìn)行2倍稀釋時(shí)菌液濃度為107 CFU/mL。

細(xì)菌定量試驗(yàn)工作菌液：馬腺疫鏈球菌獸疫亞種CVCC556調(diào)至OD600為0.18，再進(jìn)行10倍稀釋時(shí)菌液濃度為7.3×106～4.2×107 CFU/mL;多殺性巴氏桿菌CVCC399調(diào)至OD600為0.15，再進(jìn)行10倍稀釋時(shí)菌液濃度為8.7×106～5.0×107 CFU/mL。

細(xì)菌定性試驗(yàn)工作菌液：馬腺疫鏈球菌獸疫亞種CVCC556調(diào)至OD600為0.18，再進(jìn)行100倍稀釋時(shí)菌液濃度為8.3×105～3.9×106 CFU/mL;多殺性巴氏桿菌CVCC399調(diào)至OD600為0.15，再進(jìn)行100倍稀釋時(shí)菌液濃度為7.6×105～4.1×106 CFU/mL。

2.2?中和劑選擇結(jié)果

中和劑選擇試驗(yàn)以大腸桿菌8099為指示菌，試驗(yàn)中所用消毒劑的濃度為殺菌試驗(yàn)中使用的最高濃度，即1∶100稀釋。由表1可知，0.5%硫代硫酸鈉可有效中和過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉水溶液。

2.3?細(xì)菌定量試驗(yàn)結(jié)果

過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)馬腺疫鏈球菌獸疫亞種及多殺性巴氏桿菌的定量試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)馬腺疫鏈球菌獸疫亞種的有效殺菌濃度為1 600倍稀釋，對(duì)多殺性巴氏桿菌的有效殺菌濃度為3 200倍稀釋。

2.4?細(xì)菌定性試驗(yàn)結(jié)果

過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)馬腺疫鏈球菌獸疫亞種及多殺性巴氏桿菌的定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)馬腺疫鏈球菌獸疫亞種的最低有效濃度為3 200倍稀釋，該濃度的最短作用時(shí)間為60 min;過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)多殺性巴氏桿菌的最低有效濃度為3 200倍稀釋，該濃度的最短作用時(shí)間為30 min。

3?討論

馬腺疫鏈球菌獸疫亞種是重要的人獸共患病病原，能引起人和豬的腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎及突發(fā)性死亡，近年來(lái)由馬腺疫鏈球菌獸疫亞種引起的豬鏈球菌病對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。該試驗(yàn)所用的馬腺疫鏈球菌獸疫亞種CVCC556分離基物為敗血癥豬心血，為強(qiáng)毒株。從過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)馬腺疫鏈球菌獸疫亞種的定量、定性殺滅試驗(yàn)中可以看出當(dāng)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉稀釋1 600倍時(shí)殺菌率為100%，最低有效濃度為3 200倍稀釋，作用60 min培養(yǎng)基澄清，可達(dá)到消毒效果。

多殺性巴氏桿菌對(duì)多種動(dòng)物和人類都有致病性，豬多殺性巴氏桿菌也稱豬肺疫，是豬群中常見(jiàn)的呼吸道傳染病，該病全年任何季節(jié)都能發(fā)生，也可繼發(fā)其他傳染病，最急性型患豬一般呈敗血癥，病豬往往突然發(fā)病并快速死亡，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害較大[9-10]。該試驗(yàn)所用的多殺性巴氏桿菌CVCC399分離于出血性敗血癥的豬。從過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)多殺性巴氏桿菌的定量、定性殺滅試驗(yàn)中可以看出當(dāng)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉稀釋3 200倍時(shí)殺菌率為100%;最低有效濃度為3 200倍稀釋，作用30 min培養(yǎng)基澄清，可達(dá)到消毒效果。

綜上所述，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)馬腺疫鏈球菌獸疫亞種和多殺性巴氏桿菌具有良好的消毒效果。但該研究?jī)H選擇了2種致病菌進(jìn)行效果驗(yàn)證，今后還需評(píng)估該消毒劑對(duì)其他常見(jiàn)病原的消毒效果，以完善可殺滅微生物的類別，對(duì)該產(chǎn)品在豬場(chǎng)中的應(yīng)用起到指導(dǎo)作用。

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