陳盈盈 官錦燕 譚嘉娜 羅劍飄 黃海英 文明富 羅青文

摘? 要：以辣木分生組織為材料，采用酶解去壁低滲法制片，探討不同取材部位、預(yù)處理方式和酶解時(shí)間對(duì)辣木染色體制片的影響，并對(duì)其進(jìn)行核型分析，以期為辣木的起源、演化及遺傳育種提供一定理論依據(jù)。結(jié)果表明：以辣木新枝莖尖為最佳取材部位，用飽和對(duì)二氯苯預(yù)處理2 h，再用4%纖維素酶和5%果膠酶混合物酶解4 h，制片所得染色體效果最佳。核型分析表明，辣木染色體屬于小染色體，有28條，核型公式為2n=2x=2n=28m，屬于1B類(lèi)型，核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)60.29%，核型對(duì)稱(chēng)程度較高，這表明辣木在進(jìn)化中可能處于比較原始類(lèi)型。

關(guān)鍵詞：辣木;染色體制片;核型分析;莖尖中圖分類(lèi)號(hào)：Q943.2;S31 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Optimization of Chromosome Sectioning and Karyotype Analysis ofMoringa oleifera

CHEN Yingying， GUAN Jinyan， TAN Jiana， LUO Jianpiao， HUANG Haiying， WEN Mingfu， LUO Qingwen^*

Guangdong Bioengineering Institute （Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute） / Guangdong Key Laboratory of Sugarcane Improvement and Biorefinery， Guangzhou， Guangdong 510316， China

Abstract： Chromosome mounting technique was optimized to explore the chromosome karyotype of Moringa oleifera， to provide important cytological evidences for the study of the evolution， evolutionary characteristics and genetic regularity of camphor plants. The effects of different sampling position， pretreatment methods and enzymatic hydrolysis time on the production ofM. oleiferawere discussed by the enzymatic dissociation wall low permeability method， microscope observation and photography. The observation showed that the best sampling position was the tips of new branches. Samples pretreated in p-dichlorobenzene for 2?h， dissociated in 4% cellulase and 5% pectinase for 4 h could achieve the optimal experimental results. Karyotype analysis showed that the chromosome number was 28， and the karyotype formula was 2n=2x=2n=28m. The results demonstrated that the asymmetry indexes was 60.29%， and the karyotype was 1B type， suggesting thatM. oleiferawas possibly relatively primitive in the evolution.

Keywords： Moringa oleifera; chromosome sectioning; karyotype analysis; stem tip

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.06.015

辣木（Moringa oleifera Lam），又稱(chēng)鼓槌樹(shù)，屬辣木科（Moringaceae）辣木屬（Moringa）多年生喬木，原產(chǎn)于印度和非洲，辣木科僅有1屬14種[1^-2]。辣木含有豐富的纖維、維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、辣木素、皂苷、酚類(lèi)和活性酶類(lèi)等成分，具有消炎、抑菌、降血糖、降膽固醇、凝血、抗氧化、抗腫瘤和癌癥等功能[3-4]。因此，辣木又被譽(yù)為“神奇之樹(shù)”和“母親最好的朋友”。很多發(fā)展中國(guó)家利用辣木來(lái)改善兒童營(yíng)養(yǎng)不良，辣木具有食用、園林造景、工業(yè)、藥用等多種用途[5]。

染色體核型分析技術(shù)能明確識(shí)別各個(gè)染色體的特征，有助于基因定位的研究，它是細(xì)胞遺傳學(xué)的一項(xiàng)基本技術(shù)，也是染色體工程、細(xì)胞分類(lèi)學(xué)和植物育種學(xué)一個(gè)不可缺少的手段[6-7]。目前，辣木細(xì)胞學(xué)上的研究?jī)H局限于辣木染色體數(shù)量和倍性的研究。Puri等[8]以印度多油辣木材料的小孢子發(fā)育，觀察到二倍體染色體數(shù)2n=28;張潔等[9]以多油辣木栽培品種‘PKM1的莖尖為材料，同樣得出二倍體染色體數(shù)2n=28;Mendioro等[10]以花蕾為材料，也得出二倍體染色體數(shù)2n=28;魏靜[1^1]和向素瓊等[1^2]均以辣木莖尖為材料，均確定辣木為二倍體，染色體數(shù)2n=28，初步得出染色體長(zhǎng)度和染色體組總長(zhǎng)度。但最后均未能得到臂比、著絲點(diǎn)位置、核型的不對(duì)稱(chēng)程度和核型公式等核型指標(biāo)，進(jìn)而進(jìn)行核型分析。至今，有關(guān)辣木染色體核型分析的研究未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究對(duì)辣木染色體制片技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，并進(jìn)行核型分析研究，摸索出成熟的辣木染色體制片技術(shù)，得出辣木的核型公式和不對(duì)稱(chēng)程度，為辣木的起源、演化及遺傳育種提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為印度辣木的莖尖和嫩葉，采自廣東省生物工程研究所湛江甘蔗研究中心實(shí)驗(yàn)基地。

1.2? 方法

1.2.1 ?取材和預(yù)處理 ?于上午9∶00—11∶00取健壯的新枝莖尖，長(zhǎng)度小于3?mm的幼葉（以下簡(jiǎn)稱(chēng)小葉）以及長(zhǎng)度在3～8?mm幼葉（以下簡(jiǎn)稱(chēng)大葉），分別置于0.002?mol/L 8-羥基喹啉處理2?h。清水沖洗后轉(zhuǎn)入卡諾固定液[無(wú)水乙醇-冰乙酸（3∶1，V/ V）]，固定24?h，再用70%乙醇4?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5

方法，進(jìn)行預(yù)處理梯度實(shí)驗(yàn)。清水沖洗后轉(zhuǎn)入卡諾固定液[無(wú)水乙醇-冰乙酸（3∶1，V/V）]，固定24?h，70%乙醇4?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?染色體標(biāo)本制備? 染色體標(biāo)本制備采用酶解去壁低滲法^[13-14]，具體步驟參照官錦燕^[15]。

（1）先把材料置于蒸餾水前低滲30?min;（2）再置于5%纖維素酶和4%果膠酶混合液中，在37?℃中酶解2、3、4、5?h;（3）吸取酶液，加入蒸餾水后低滲30 min;（4）吸取蒸餾水，滴加臨時(shí)配制的固定液[3（乙醇）∶1（冰乙酸）]后固定15?min;（5）涂片，載玻片上先滴3滴固定液，夾取少量莖尖組織或葉片邊緣組織，迅速涂抹在載玻片上，且在火焰上迅速烘烤;（6）染色，用吉姆薩染色15?min，沖洗玻片干燥后再鏡檢。

1.2.3 ?核型分析? 用POTIKA正立顯微鏡觀察，Optika Vision pro拍照系統(tǒng)拍照，在40×物鏡下對(duì)單位視野面積內(nèi)處于分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)^[16]。選擇30個(gè)染色體分散且形態(tài)較好的細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)，選取5個(gè)染色體形態(tài)清晰且無(wú)重疊的細(xì)胞用Photoshop圖像軟件進(jìn)行核型分析。核型分析方法根據(jù)李懋學(xué)等^[17]的標(biāo)準(zhǔn)，染色體形態(tài)依據(jù)Levan等^[18]的方法歸類(lèi)，核型對(duì)稱(chēng)性按Stebbins^[19]的標(biāo)準(zhǔn)劃分。

臂比（r）=長(zhǎng)臂（S）/短臂（L）

染色體相對(duì)長(zhǎng)度=染色體長(zhǎng)度/染色體組總度×100%

染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)（I. R. L）=每條染色體相對(duì)長(zhǎng)度/染色體平均相對(duì)長(zhǎng)度

平均長(zhǎng)度核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)（As. k）=長(zhǎng)臂總長(zhǎng)/全組染色體總長(zhǎng)×100%

2 ?結(jié)果與分析

2.1辣木染色體制片技術(shù)優(yōu)化

2.1.1 ?不同取材部位對(duì)中期細(xì)胞比率和形態(tài)的影響 ?從表2可知，不同取材部位對(duì)中期細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)的影響均較大。3種材料中期細(xì)胞所占比率分別為莖尖22.6%、小葉14.3%、大葉5.4%;適合核型分析的中期細(xì)胞比率為莖尖18.2%、小葉7.8%、大葉1.3%。由此可見(jiàn)，莖尖所含的中期細(xì)胞比率明顯大于小葉和大葉的。由于莖尖是分生組織，新陳代謝快，細(xì)胞活動(dòng)最活躍，中期分裂相最多;小葉邊緣組織的新陳代謝又比大葉的快，分裂相也明顯比大葉多。從中期細(xì)胞的形細(xì)胞小，細(xì)胞質(zhì)厚，染色體不分散態(tài)來(lái)看，莖尖細(xì)胞大，細(xì)胞質(zhì)稀薄，背景干凈，且染色體也較分散，更有利于細(xì)胞的核型分析。結(jié)合中期細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞形態(tài)可判斷，莖尖可作為最佳的取材部位，辣木全年生長(zhǎng)，新枝莖尖多，取材方便。

2.1.2 ?不同預(yù)處理方法對(duì)染色體制片效果的影響 ?6種不同預(yù)處理方法對(duì)辣木莖尖處理的結(jié)果（圖1，表3）表明，不同預(yù)處理方法對(duì)中期細(xì)胞數(shù)目，染色體分散效果及清晰度都有一定的影響。飽和對(duì)二氯苯比8-羥基喹啉所得的中期細(xì)胞比率要高，飽和對(duì)二氯苯處理2 h的中期細(xì)胞比率為24.5%，明顯高于其他處理組（表3）。其相對(duì)應(yīng)的處理效果也最好（表3，圖1B2），染色體分散，聚縮，形態(tài)清晰，可見(jiàn)溢痕，很適合染色體核型分析。其次是8-羥基喹啉預(yù)處理2.5 h（圖1A2），染色體分散，聚縮，形態(tài)清晰。而飽和對(duì)二氯苯處理1.5、3 h和8-羥基喹啉處理2、3 h（圖1A1，圖1A3，圖1B1，圖1B3），效果均不理想，染色體形態(tài)較模糊，不利于核型分析。

2.1.3? 不同酶解時(shí)間對(duì)染色體制片效果的影響? 從不同酶解時(shí)間對(duì)制片效果的影響可知（表4），酶解時(shí)間對(duì)染色體分散效果及清晰度影響較大，特別是細(xì)胞背景的干凈程度。最適合的酶解時(shí)間是4 h，此時(shí)細(xì)胞背景干凈，染色體分散性良好，形態(tài)清晰，最適合核型分析。酶解2、3?h的細(xì)胞背景和染色體形態(tài)不夠理想;酶解5?h細(xì)胞極易破裂，造成染色體丟失。

2.2辣木核型分析

2.2.1 ?染色體數(shù)目? 辣木染色體數(shù)目為2n=28，為二倍體。

2.2.2 ?核型特征? 辣木核型分析參數(shù)（表5）和染色體核型圖（圖2）分析結(jié)果表明：辣木核型公式為2x=2n=28=28m，全部為中部著絲粒染色體（m），未發(fā)現(xiàn)有隨體。染色體絕對(duì)總長(zhǎng)為22.9?μm，絕對(duì)長(zhǎng)度范圍1.098～3.3?μm，屬于小型染色體。染色體相對(duì)長(zhǎng)度為3.96～14.35%，相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=28=8L+2M₂+6M₁+12S;最長(zhǎng)與最短染色體長(zhǎng)度比值為3.62，臂比值范圍為1.27～1.66，沒(méi)有臂比大于2的染色體，核型不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為60.29%，核型類(lèi)型屬于1B型。