王夢(mèng)馨 吳國(guó)火 崔林 韓寶瑜

摘? 要：為研究Cu/Zn-SOD基因在茶樹(shù)花不同發(fā)育階段、不同品種間的表達(dá)規(guī)律以及Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量與酶活性之間的關(guān)系，本研究將‘龍井43品種茶樹(shù)花分為4個(gè)發(fā)育階段，選擇15個(gè)品種的茶樹(shù)花為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)3個(gè)Cu/Zn-SOD基因表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，同時(shí)測(cè)定Cu/Zn-SOD酶活性。結(jié)果表明：在茶樹(shù)花的4個(gè)發(fā)育階段中，第4階段Cu/Zn-SOD酶活性最低，與其他3個(gè)階段具有顯著差異;不同品種的茶樹(shù)花Cu/Zn-SOD酶活性有較大差異，其中‘紫鵑茶樹(shù)花Cu/Zn-SOD酶活性最高，其次是‘黃金芽和‘白葉1號(hào)，‘黃觀音的Cu/Zn-SOD酶活性最低。茶樹(shù)花不同發(fā)育階段中Cu/Zn-SOD基因表達(dá)水平存在較大差異，細(xì)胞質(zhì)型Cu/Zn-SOD1基因表達(dá)水平遠(yuǎn)高于葉綠體型Cu/Zn-SOD2和過(guò)氧化物酶體Cu/Zn-SOD3;不同品種茶樹(shù)花Cu/Zn-SOD基因表達(dá)水平有較大差異，Cu/Zn-SOD1基因在‘黃牡丹茶樹(shù)花中表達(dá)量最高，Cu/Zn-SOD2基因在‘白葉1號(hào)和‘黃觀音茶樹(shù)花中表達(dá)量最高，Cu/Zn-SOD3基因在‘紫鵑茶樹(shù)花中的表達(dá)量最高。相關(guān)性分析得知‘龍井43茶樹(shù)花不同發(fā)育階段Cu/Zn-SOD酶活性與Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量之間的相關(guān)性不明顯，而不同品種茶樹(shù)花的Cu/Zn-SOD酶活性與Cu/Zn-SOD3基因表達(dá)量存在顯著相關(guān)性。本研究初步明確了Cu/Zn-SOD酶活性較高的茶樹(shù)品種和茶樹(shù)花適宜的采摘時(shí)間，為茶樹(shù)花SOD進(jìn)一步研究提供參考。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù)花;Cu/Zn-SOD基因;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;Cu/Zn-SOD酶活性;‘龍井43中圖分類號(hào)：S571.1 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Enzyme Activity Characteristics and Expression ofCu/Zn-SODGene in Tea Flowers

WANG Mengxin， WU Guohuo， CUI Lin， HAN Baoyu^*

College of Life Sciences， China Metrology University / Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection & Quarantine， Hangzhou， Zhejiang 310018， China

Abstract：In order to study the expression characteristics ofCu/Zn-SODgene in the flowers within different developmental stages and various cultivars of tea plant flowers， and to discuss the correlationship between the expression ofCu/Zn-SODgene and its enzyme activity， four developmental stages of cultivar ‘Longjing 43 tea flower and 15 tea plant cultivars of fresh flowers were studied. The expression of threeCu/Zn-SODgenes was quantitatively analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR techniques， and the enzyme activity of the three Cu/Zn-SOD was also determined simultaneously. The lowest Cu/Zn-SOD enzyme specific activity was found in the fourth stage， and the difference was significant when compared with the other developmental stages. The specific activity of Cu/Zn-SOD enzyme in different cultivars of tea flowers was significantly different. The Cu/Zn-SOD enzyme specific activity of ‘Zijuan tea flower was the highest， followed by ‘Huangjinya and ‘Baiye 1. The activity of Cu/Zn-SOD enzyme of ‘Huangguanyin tea flower was the lowest. The expression level ofCu/Zn-SODdiffered among the developmental stages， and the expression of cytoplasmicCu/Zn-SOD1gene was much higher than those of chloroplast typeCu/Zn-SOD2and peroxisomeCu/Zn-SOD3. The expression ofCu/Zn-SODin different cultivars was significantly different.Cu/Zn-SOD1had the highest expression in cultivar ‘Huangmudan tea flower，Cu/Zn-SOD2gene had the highest expression in cultivars ‘Baiye 1 and ‘Huangguanyin tea flowers， andCu/Zn-SOD3gene had the highest expression in cultivar ‘Zijaun tea flowers. The result of correlation analysis showed that the specific activity of Cu/Zn-SOD had no correlation withCu/Zn-SOD gene expression in different developmental stages of ‘Longjing 43 tea flowers， but had considerable correlation withCu/Zn-SOD3 gene expression in different tea cultivars. In this study， both tea cultivars and suitable plucking stage with high Cu/Zn-SOD activity were preliminarily expounded， which would provide references for the further research on SOD.

Keywords： tea plant flowers;Cu/Zn-SODgene; real time fluorescence quantitative PCR; Cu/Zn-SOD enzyme activity; cultivar ‘Longjing 43

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.06.014

茶樹(shù)花是茶樹(shù)（Camellia sinensis（L.） O. Kuntze）的有性生殖器官^[1]，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、香精油、茶多糖、維生素等營(yíng)養(yǎng)和功能成分及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等活性物質(zhì)^[2-6]，對(duì)人體具有解毒、降脂、降糖、保護(hù)腸胃、增強(qiáng)免疫力和抗氧化等功效^[7-8]。2013年衛(wèi)生部第1號(hào)文件批準(zhǔn)茶樹(shù)花為新資源食品，允許直接開(kāi)發(fā)和利用。研究發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)花含有抗氧化活性物質(zhì)，有較強(qiáng)抗氧化功能，可與抗氧化植物迷迭香相媲美^[9]，其中SOD酶起重要作用^[10]。SOD酶是一種生物內(nèi)源性抗氧化劑，可通過(guò)歧化作用清除體內(nèi)超氧陰離子自由基，減輕對(duì)細(xì)胞的損傷，在維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能中起著十分關(guān)鍵的作用^[11]，其研究已深入到食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域，應(yīng)用范圍廣泛。根據(jù)金屬輔因子的不同SOD酶可分為3類，即Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD^[12]。Cu/Zn-SOD酶是SOD結(jié)構(gòu)的第一族，在SOD酶中比例最大，占SOD總量86%^[13]。一般植物來(lái)源的SOD為Cu/Zn-SOD，包括細(xì)胞質(zhì)型、葉綠體型及過(guò)氧化物酶體型3個(gè)類型^[14]，其在活性氧清除的酶系中尤為重要，與植物的抗寒、耐鹽堿等多種抗逆性關(guān)系密切^[15-16]，且植物源SOD有利于人體吸收，使用安全性高，對(duì)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益明顯，市場(chǎng)前景廣闊。目前有關(guān)茶樹(shù)中超氧化物歧化酶的研究主要集中于SOD酶在逆境脅迫中的作用^[17-18]，對(duì)茶樹(shù)花中超氧化物歧化酶的研究主要在SOD酶抗氧化、提取工藝方面^[19-20]，對(duì)SOD酶活及其基因表達(dá)的報(bào)道較少。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)上述3類Cu/Zn-SOD基因在‘龍井43品種茶樹(shù)花不同發(fā)育階段中和15個(gè)栽培品種茶樹(shù)花表達(dá)水平做定量分析，同時(shí)測(cè)定Cu/Zn-SOD酶活性，以探明3類Cu/Zn-SOD基因在茶樹(shù)花不同發(fā)育階段之間、茶樹(shù)品種之間的表達(dá)差異，解析Cu/Zn-SOD基因表達(dá)水平與Cu/Zn-SOD酶活性之間的關(guān)系，以初步明確茶樹(shù)花適宜采摘時(shí)間和Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量高的茶樹(shù)花品種，為茶樹(shù)花SOD酶的研發(fā)提供參考。

1? 材料與方法

1.1 材料

2017年11月于中國(guó)計(jì)量大學(xué)試驗(yàn)茶園（30°19?29.90? N，120°21?19.16? E，海拔11?m）中，參照劉晶晶等^[21]方法采摘5年生的‘龍井43品種茶樹(shù)上4個(gè)不同發(fā)育階段的花（第1階段：花瓣露白，第2階段：花瓣初綻，第3階段：完全綻放，第4階段：花瓣開(kāi)?。┮约傲硗?4個(gè)國(guó)家級(jí)茶樹(shù)良種5年生茶樹(shù)上第3階段的花（圖1）。液氮速凍后，置于?80?℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1? Cu/Zn-SOD酶活性的測(cè)定? 準(zhǔn)確稱取樣品0.25?g，加入1?mL預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（pH?7.4，0.01?mol/L Tris-HCl，0.0001?mol/L EDTA-2Na，0.01?mol/L蔗糖，0.8%?NaCl），冰浴條件下進(jìn)行勻漿，制成20%的勻漿液，3500?r/min，離心10?min，取上清液待測(cè)。采用南京建成生物工程研究所提供的黃嘌呤氧化酶法（植物銅鋅超氧化物歧化酶測(cè)試盒A001-4）測(cè)定樣品Cu/Zn-SOD酶活性。每毫克植物組織蛋白在1?mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量定義為1個(gè)SOD活力單位（U）。

1.2.2? 總RNA提取及cDNA合成? 參照天根RNAprep Pure Plant Plus Kit試劑盒操作方法提取各樣品總RNA，測(cè)得RNA濃度及A₂₆₀/A₂₈₀值在1.8～2.0之間。RNA的完整性通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，提取的總RNA有明顯的28S和18S兩條帶，亮度比例大致為2∶1左右，且無(wú)拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明所提取的總RNA完整。按照PrimSctipt^TM RT Reagent Kit （Perfect Real Time） 操作方法，將各樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。獲得的cDNA產(chǎn)物直接用于PCR或–20?℃貯藏備用。

1.2.3? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 ?以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用基因?qū)Ｒ恍砸?sup>[22]（表1）進(jìn)行相關(guān)基因的熒光定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）選取GAPDH作為內(nèi)參基因^[23]進(jìn)行校正。qRT-PCR方法參照SYBR Premix Ex Taq^TM（TaKaRa）試劑盒?？傮w系20?μL﹕10?μL SYBR Premix Ex Taq（2×）、10??mol/L上引物和下引物各0.4??L、ROX Reference Dye（50×）0.4??L、2??L cDNA、加無(wú)菌水補(bǔ)足至20??L。反應(yīng)在熒光定量PCR儀（ABI stepone plus）上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5?℃預(yù)變性1 min;95?℃變性15?s， 58?℃退火25?s，共45個(gè)循環(huán)，最后從55～95?℃記錄溶解曲線。通過(guò)分析溶解曲線，確定擴(kuò)增產(chǎn)物為單一PCR產(chǎn)物。樣品和內(nèi)參分別重復(fù)3次。采用2^-ΔΔCt方法進(jìn)行基因表達(dá)水平分析。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析，利用Duncans 新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析;采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? ‘龍井43茶樹(shù)花的4個(gè)發(fā)育階段及不同品種茶樹(shù)花Cu/Zn-SOD酶活性的差異分析

在‘龍井43茶樹(shù)花的4個(gè)發(fā)育階段中，Cu/Zn-SOD酶活性具有差異（圖2）。隨著茶樹(shù)花的逐漸發(fā)育，Cu/Zn-SOD酶活性呈下降趨勢(shì)。Cu/Zn-SOD酶活性由高到低順序依次為：第1階段>第3階段>第2階段>第4階段。第1階段Cu/Zn-SOD酶活性最高，顯著高于第4階段（P< 0.05），但與第2、第3階段酶活性差異不顯著。

對(duì)15個(gè)茶樹(shù)品種茶樹(shù)花第3發(fā)育階段的酶活性測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)：‘紫鵑（編號(hào)15）和‘黃金芽（編號(hào)9）茶樹(shù)花Cu/Zn-SOD酶活性最高，顯著高于其他品種茶樹(shù)花（P<0.05）。其次是‘白葉1號(hào)（編號(hào)5）、‘中茶108（編號(hào)3）和‘龍井43（編號(hào)1）?！S觀音（編號(hào)12）茶樹(shù)花酶活性最低，‘紫鵑酶活性是‘黃觀音的2.3倍左右（圖3）。

2.2‘龍井43茶樹(shù)花Cu/Zn-SOD基因表達(dá)的變化

在‘龍井43品種茶樹(shù)花的4個(gè)發(fā)育階段中，選擇第3發(fā)育階段3個(gè)Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)水平為對(duì)照，即1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位，據(jù)此分別計(jì)算3個(gè)Cu/Zn-SOD基因在其他3個(gè)發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)Cu/Zn-SOD基因在‘龍井43茶樹(shù)花的4個(gè)不同發(fā)育階段的表達(dá)水平都有較大差別（圖4）。其中，Cu/Zn-SOD1基因的表達(dá)水平隨著茶樹(shù)花的發(fā)育而上調(diào)，在第4階段達(dá)到最大值，顯著高于其他階段（P<0.05），是對(duì)照的1.2倍左右;Cu/Zn-SOD2基因表達(dá)水平呈先下降、后上升、再下降的趨勢(shì)，在第3階段達(dá)到最大值;Cu/Zn- SOD3基因表達(dá)水平呈先上升、后下降的趨勢(shì)，在第2階段達(dá)到最大值，是對(duì)照的1.2倍左右。

茶樹(shù)花的4個(gè)發(fā)育階段中的表達(dá)差異：在各個(gè)發(fā)育階段中分別選用Cu/Zn-SOD1基因的表達(dá)水平為對(duì)照，即1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位，據(jù)此計(jì)算Cu/Zn-SOD2、Cu/Zn-SOD3基因在第1、2、3、4發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)水平（圖5），發(fā)現(xiàn)‘龍井43茶樹(shù)花的4個(gè)發(fā)育階段中Cu/Zn-SOD1基因表達(dá)水平最高，均顯著高于其他2個(gè)基因（P<0.05）;在茶樹(shù)花第1發(fā)育階段，Cu/Zn-SOD1基因表達(dá)水平是Cu/Zn- SOD2基因表達(dá)水平的8倍左右，是Cu/Zn-SOD3基因的30倍以上;在茶樹(shù)花的第2發(fā)育階段，Cu/Zn-SOD1表達(dá)水平是Cu/Zn-SOD2的18倍，是Cu/Zn-SOD3的30倍;在茶樹(shù)花的第3發(fā)育階段，Cu/Zn-SOD1表達(dá)水平是Cu/Zn-SOD2、Cu/Zn- SOD3的30倍以上，Cu/Zn-SOD2的是Cu/Zn-SOD3的1.4倍左右;在茶樹(shù)花的第4發(fā)育階段，Cu/Zn- SOD1的是Cu/Zn-SOD2的40倍，是Cu/Zn-SOD3的80倍以上。

2.3不同品種茶樹(shù)花Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)差異分析

在15個(gè)茶樹(shù)品種的茶樹(shù)花發(fā)育的第3階段中，Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)水平存在明顯差異（圖6）。分別以‘龍井43茶樹(shù)花的3個(gè)Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)水平作為對(duì)照。結(jié)果顯示，Cu/Zn- SOD1基因在‘黃牡丹（編號(hào)14）茶樹(shù)花中表達(dá)量最高，是對(duì)照的2.4倍左右，與其他品種差異顯著（P<0.05）。其次為‘鳩坑早（編號(hào)7）和‘紫鵑（編號(hào)15），皆顯著高于其他品種茶樹(shù)花（P<0.05），而在‘金觀音（編號(hào)11）中表達(dá)量最低。Cu/Zn-SOD2基因在‘白葉1號(hào)（編號(hào)5）、‘黃觀音（編號(hào)12）和‘龍井43（對(duì)照，編號(hào)1）茶樹(shù)花中表達(dá)量最高，‘金觀音（編號(hào)11）和‘中茶108（編號(hào)3）表達(dá)量最低。Cu/Zn-SOD3基因在‘紫鵑（編號(hào)15）茶樹(shù)花中表達(dá)量最高，是對(duì)照的2倍左右，其次為‘黃金芽‘白葉1號(hào)‘紫牡丹‘金觀音等，其中‘平陽(yáng)特早（編號(hào)2）表達(dá)量最低。

2.4茶樹(shù)花Cu/Zn-SOD酶活性與基因表達(dá)水平的相關(guān)性

對(duì)15個(gè)品種茶樹(shù)花中每個(gè)Cu/Zn-SOD基因表達(dá)水平與Cu/Zn-SOD酶活性之間關(guān)聯(lián)度進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)Cu/Zn-SOD3基因的表達(dá)水平與Cu/Zn-SOD酶活性呈顯著性相關(guān)性（P<0.05），其他2個(gè)Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)水平與Cu/Zn-SOD酶活性的相關(guān)系數(shù)均未達(dá)到顯著性水平（表2）。分析‘龍井43茶樹(shù)花整個(gè)發(fā)育階段（第1～4階段）每個(gè)Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量與Cu/Zn-SOD酶活性之間關(guān)聯(lián)度（表3），相關(guān)系數(shù)均未達(dá)到顯著性水平。

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