李晶 王澤輝 陳莉 劉艷玲 夏舒寧 林占熺

摘? 要：實時熒光定量PCR（quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)具有較高的敏感性、準確性和特異性，被廣泛應(yīng)用于基因表達分析。在基因表達分析中，選擇合適的內(nèi)參基因是衡量樣品表達量和準確性的重要前提和保障。本研究以液體發(fā)酵7、21、35 d的牛樟芝菌絲體為樣本，采用qRT-PCR技術(shù)檢測牛樟芝菌絲體內(nèi)Actin、TPK、Floxuridine、CAP-Gly、α-Amylase、Phosphatase、HA2-helicase、MAGT1等8個候選內(nèi)參基因在3組樣本中的表達水平，采用geNorm、NormFinder、BestKeeper 3個軟件對其分別進行穩(wěn)定性比較和評價。結(jié)果表明，geNorm軟件計算得出Floxuri?dine、HA2-helicase、TPK、CAP-Gly在牛樟芝菌絲體中具有更高的穩(wěn)定性;NormFinder軟件計算得出TPK、CAP-Gly、Floxuridine、HA2-helicase在牛樟芝菌絲體中具有較高的穩(wěn)定性;BestKeeper軟件計算得出HA2-helicase的表達水平最好，其次是TPK和MAGT1。綜合分析結(jié)果認為TPK和HA2-helicase比其他內(nèi)參基因更穩(wěn)定，更適合作為牛樟芝菌絲體研究的內(nèi)參基因。可見，通過牛樟芝菌絲體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來篩選和挖掘穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因具有可靠性、高效性和可行性，為牛樟芝菌絲體基因表達分析提供了可靠的內(nèi)參基因。

關(guān)鍵詞：牛樟芝;內(nèi)參基因;實時熒光定量PCR中圖分類號：S567.3;R282 ?????文獻標識碼：A

Reference Genes Selection for Quantitative Real-time PCR inAntrodia cinnamomea Mycelium of Different Development Stages

LI Jing¹， WANG Zehui^1，2， CHEN Li²， LIU Yanling¹， XIA Shuning²， LIN Zhanxi^1*

1. China National Engineering Research Center of JUNCAO Technology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. College of Life Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract： Quantitative Real-time PCR （qRT-PCR） technology is widely used in the analysis of gene expression because of its high sensit-ivity， high accuracy and high specificity. Therefore， it is important to select appropriate reference genes to measure the expression and accuracy of the sample. In this study， the expressions of 18 candidate internal reference genes ofActin，TPK，Floxuridine，CAP-Gly，α-Amylase，Phosphatase，HA2- helicaseandMAGT1were detected by qRT-PCR withA. cinnamomeaMycelium under 7， 21 and 35 d liquid fermentation time. The stability of the internal reference genes were analyzed using softwares of geNorm， NormFinder and BestKeeper.Floxuridine/HA2-helicase，TPK，CAP-Glygenes were found more stable with geNorm.TPK，CAP-Gly，Floxuridine，HA2-helicasewere found more stable with NormFinder.HA2-helicasewas found to be best expressed with BestKeeper， followed byTPKandMAGT1. The comprehensive analysis showed thatTPKandHA2-helicasehad the best stability and were more suitable as the internal reference genes forA. camphorata. The results of this study would have a practical guiding role in the analysis of the selection of internal reference genes in the gene expression ofA. cinnamomeaby qRT-PCR.

Keywords： Antrodia cinnamomea; reference gene; quantitative Real-time PCR

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.06.013

隨著轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在復(fù)雜生物學過程、代謝途徑及逆境生理脅迫等相關(guān)研究中的廣泛應(yīng)用，實時熒光定量PCR技術(shù)（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）成為生物學中研究基因定量表達最常見、簡單、快速的方式之一，具有高靈敏性和特異性，被廣泛應(yīng)用于分子醫(yī)學、食品安全檢測和病蟲害防治^[1-2]。qRT-PCR對樣本的RNA和cDNA的質(zhì)量、完整性、引物特異性、擴增效率以及內(nèi)參基因的選擇具有較嚴格的要求。內(nèi)參基因（reference genes）是指在細胞中能夠穩(wěn)定表達的一類基因，是細胞基本轉(zhuǎn)錄組的成分之一，它參與維持細胞的基本功能。內(nèi)參基因的基本功能是消除不同樣品間RNA的提取質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率等對定量表達分析造成的偏差，起到校正的作用^[3]。因此，隨著基因表達的深入研究，選擇合適的內(nèi)參基因是保障實驗分析結(jié)果準確性的重要前提^[4]。目前，在真菌中常用的內(nèi)參基因包括肌動蛋白（actin）、泛素（ubiquitin，UBQ）、18S核糖體RNA（18S rRNA）、微管蛋白（tubulin beta，TUB）和翻譯延長因子（translation elongation factor，TEF）等。然而，內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著生物體發(fā)育階段和實驗條件的變化而有所差異^[5-6]，在研究過程中，若選擇不能穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，將對實驗結(jié)果的準確性產(chǎn)生巨大影響。

牛樟芝（Antrodia cinnamomea）為臺灣地區(qū)常見藥用菌，又名樟芝、樟菇、牛樟菇、紅樟芝，屬擔子菌門（Basidiomycota）、薄孔菌屬（Basi?diomycetes）^[7]。牛樟芝僅生在中國臺灣保育樹種牛樟樹（Cinnamomum kanehiraiHay）中空的樹干內(nèi)部或腐爛的樹干表面^[8]。近年來，隨著對牛樟芝分子生物學研究的不斷深入，qRT-PCR技術(shù)成為重要研究手段之一，而選擇表達高效、穩(wěn)定的內(nèi)參基因是開展qRT-PCR的關(guān)鍵。目前，對于牛樟芝內(nèi)參基因的研究報道較少，本研究選取3種不同階段牛樟芝菌絲體，利用qRT-PCR技術(shù)篩選來自牛樟芝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的8個候選內(nèi)參基因，采用geNorm^[9]、NormFinder^[10]和BestKeeper^[11]軟件進行基因的穩(wěn)定性評估，從而選擇穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，為其后續(xù)基因表達研究、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析提供更可靠的參考和校正依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1材料

牛樟芝菌株由福建農(nóng)林大學國家菌草工程技術(shù)研究中心菌種保藏室提供。將菌種接種到PDA培養(yǎng)基上進行活化，然后轉(zhuǎn)移至牛樟芝液體培養(yǎng)基，置于120?r/min搖床，在28?℃黑暗培養(yǎng)7、21、35?d，然后收集菌絲體備用^[12]。

1.2方法

1.2.1? 牛樟芝總RNA提取及cDNA合成? 參照全式金生物公司的Trizol試劑盒說明書步驟提取牛樟芝菌絲體的總RNA，每個樣品設(shè)置3次重復(fù)，采用NanoDrop 2000對提取的總RNA濃度和質(zhì)量進行檢測，合格后置于-80?℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照艾德萊生物科技公司的TRUEscript RT Master Mix試劑盒說明書步驟進行cDNA合成，每20?μL體系中含有500?ng總RNA樣品。將合成后的cDNA置于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 內(nèi)參基因的選擇與引物設(shè)計? 候選內(nèi)參基因序列是根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的序列E-value<1e-50進行篩選獲得的^[12]。利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物（表1），引物退火溫度為50～60?℃，設(shè)計的引物由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。

1.2.3? 實時熒光定量PCR? 按照全式金生物公司的SYBR TransStart實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行反應(yīng)，反應(yīng)在Bio Rad CFX96實時熒光定量PCR儀上進行。反應(yīng)總體系為20 μL：總cDNA模板1 μL，正反引物各1?μL（10 μmol/L），2×SYBR qPCR Mix 10 μL，ddH₂O補足至20 μL，每個樣品3次重復(fù)。qRT-PCR擴增程序為：95?℃預(yù)變性5?min;95?℃變性5?s，52～55?℃退火20?s，40個循環(huán)，在延伸階段采集熒光信號，反應(yīng)結(jié)束后增加60～95?℃熔解曲線分析。

1.2.4? 擴增效率分析與標準曲線繪制? 取3個cDNA樣品等量混合后，按10倍依次稀釋6個梯度作為模板，每個反應(yīng)3個重復(fù)。熔解溫度通過PCR儀計算得到，根據(jù)所得的C_t值繪制標準曲線，然后計算標準曲線方程，從而得出斜率（k）、線性相關(guān)系數(shù)（R²）、擴增效率（E）。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用PCR儀統(tǒng)計C_t值，根據(jù)公式Q=2^-ΔΔCt計算各樣品的相對表達量Q，其中ΔC_t=C_{t（樣品）}?C_t（min），C_t（min）為所有樣品中最低的C_t值。根據(jù)8個內(nèi)參基因在牛樟芝菌絲體3個發(fā)育階段的相對表達量，采用geNorm、NormFinder、BestKeeper軟件分別計算內(nèi)參基因的穩(wěn)定值，比較并確定適宜的內(nèi)參基因。

2? 結(jié)果與分析

2.1引物擴增效果及特異性分析

以等量梯度稀釋的cDNA為模板進行PCR擴增，繪制每個內(nèi)參基因的標準曲線，得到引物的相關(guān)數(shù)據(jù)（表2）。分析結(jié)果表明，候選內(nèi)參基因具有良好的擴增效果和線性相關(guān)性（表2、圖1、圖2）。

2.2內(nèi)參基因表達豐度分析

由于C_t值的變化與內(nèi)參基因的表達水平有密切關(guān)系。C_t值越高，其表達量越低，其表達豐度越低;反之，表達豐度越高。對8個內(nèi)參基因在發(fā)酵時期進行表達豐度分析，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間的增長，Actin和CAP-Gly表達豐度不隨培養(yǎng)時間的增長而增加，而其他候選內(nèi)參基因均隨培養(yǎng)時間的增長表達豐度變高（圖3）。

2.3geNorm軟件對內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價

geNorm軟件常用于實時熒光定量PCR中篩選及確定內(nèi)參基因。其分析結(jié)果以候選基因表達穩(wěn)定度M值（average expression stability values）進行排序，以M=0.5為取舍值，M值越高，穩(wěn)定性越差，相反M值越低則穩(wěn)定性越高^[9]。采用geNorm軟件分析8個候選內(nèi)參基因，結(jié)果顯示最穩(wěn)定的基因是二氫尿嘧啶核苷和HA2解旋酶（圖4）。

根據(jù)geNorm軟件計算結(jié)果，不同培養(yǎng)時期牛樟芝菌絲體中8個內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性排序前3位依次為Floxuridine/HA2-helicase>TPK>CAP-Gly，其中Floxuridine、HA2-helicase、TPK的M值都小于軟件推薦的0.5，可以作為實時熒光定量PCR分析中的內(nèi)參基因。同時，geNorm軟件根據(jù)配對變異系數(shù)來確定最佳內(nèi)參基因數(shù)目，即V_n/（n+1）<0.15說明該條件下最佳內(nèi)參基因的數(shù)目為n個。如圖5所示，只有V_2/3時，變異系數(shù)低于0.15，則在牛樟芝液體發(fā)酵時期最好使用兩個內(nèi)參基因，即H2A解旋酶和二氫尿嘧啶核苷作為內(nèi)參基因（圖5）。

2.4NormFinder軟件對候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價

NormFinder軟件是由Claus等^[10]開發(fā)的、用于篩選穩(wěn)定的內(nèi)參基因的一種程序，其計算原理與geNorm軟件相似，即結(jié)合組內(nèi)方差與組間方差計算各內(nèi)參基因的穩(wěn)定值。通過先獲得的內(nèi)參基因表達穩(wěn)定值，然后根據(jù)穩(wěn)定值大小篩選出最合適的內(nèi)參基因，判定標準為表達穩(wěn)定值最小的內(nèi)參基因為最合適的內(nèi)參基因;反之越不穩(wěn)定^[13]。表3結(jié)果顯示，篩選的內(nèi)參基因穩(wěn)定性依次是TPK>CAP-Gly>Floxuridine>HA2-helicase>Actin。其他內(nèi)參基因Phosphatase、α-Amylase、MAGT1的穩(wěn)定值>1不適合作為內(nèi)參基因^[10]。

2.5? BestKeeper軟件對候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價

BestKeeper軟件根據(jù)Q-PCR的C_t值計算各個基因的相關(guān)系數(shù)（r）、標準偏差（SD）、變異系數(shù)（CV）等，通過比較值的大小來分析內(nèi)參基因的表達水平;標準偏差（SD）>1，則內(nèi)參基因的穩(wěn)定性差，不可以用作內(nèi)參基因;相關(guān)系數(shù)（r）值越低，其穩(wěn)定性越高。軟件分析得到的結(jié)果如表4所示，根據(jù)BestKeeper軟件計算原理可知HA2-helicase的表達水平最好，其次是TPK和MAGT1。

3? 討論

隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展和推廣應(yīng)用，qRT- PCR技術(shù)由于其特異性強、靈敏度高和重復(fù)性好已成為各行業(yè)、各領(lǐng)域廣泛用于基因表達研究的技術(shù)之一^[14]。內(nèi)參基因在qRT-PCR技術(shù)應(yīng)用過程

中作為參考、對照基因具有重要作用，選擇合適的內(nèi)參基因是檢測基因表達水平變化時的重要參照物。理想的內(nèi)參基因所具有的特點包括，應(yīng)在所有組織和細胞類型中都能穩(wěn)定表達，且不受外界環(huán)境及組織形態(tài)的影響^[15]，其作用是矯正了qRT-PCR操作過程中的操作誤差，從而保證了實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和準確性。本研究通過前期實驗結(jié)果，系統(tǒng)篩選和分析了Actin、TPK、Floxu?ridine、CAP-Gly、α-Amylase、Phosphatase、HA2- helicase和MAGT1等8個候選內(nèi)參基因在牛樟芝不同培養(yǎng)階段牛樟芝菌絲體中的表達結(jié)果，經(jīng)geNorm、NormFinder、BestKeeper等常用內(nèi)參基因分析軟件對結(jié)果進行評估，其中g(shù)eNorm軟件篩選得到的最適合的內(nèi)參基因為Floxuridine、HA2-heli?case、TPK;NormFinder軟件篩選得到的最適合的內(nèi)參基因是TPK、CAP-Gly、Floxuridine、TPK;BestKeeper軟件篩選得到的最適合的內(nèi)參基因是HA2-helicase、TPK、MAGT1。由于3種軟件的分析計算方法不同，其結(jié)果也略有不同^[15-16]，該現(xiàn)象也廣泛存在于其他物種的內(nèi)參基因研究中^[17-20]。綜合分析各評估結(jié)果，認為TPK和HA2- helicase適合作為牛樟芝菌絲體qRT-PCR研究中的內(nèi)參基因。酪氨酸激酶（PTKs）基因家族是生物體信號網(wǎng)絡(luò)的核心組分，是在細胞通訊、細胞黏附、細胞增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到關(guān)鍵作用的一類生長因子，具有能促進生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、參與細胞生長、增殖、分化等功能。在目前已報道的研究中，并未發(fā)現(xiàn)該基因作為內(nèi)參基因的報道，但在研究其基因家族差異進化的過程中，發(fā)現(xiàn)PTK經(jīng)歷了更顯著的規(guī)?；瘮U張和成員基因間的功能分化，組織表達分化更明顯，催化更特異的底物發(fā)生磷酸化，參與特異的差異進化作用^[21]。通常在多數(shù)作物中，Actin和tubulin作為常見的內(nèi)參基因，韓曉雪等^[22]利用geNorm和Norm?Finder軟件分析得到Actin可以作為番茄基因表達中的內(nèi)參基因;在對日本沼蝦的研究中發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下篩選得到的β-act是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因^[23];Gopalam等^[24]研究認為在鹽脅迫條件下，Actin、EF1α、18S等在紅樹中能穩(wěn)定表達。在本研究中，采用3項軟件進行評估，結(jié)果表明Actin在牛樟芝菌絲體中的表達呈一定的波動性和不穩(wěn)定性，不能作為最適合的內(nèi)參基因。由此可見，內(nèi)參基因的表達相對穩(wěn)定性存在于特定物種和特定細胞中，因此，需要根據(jù)不同實驗條件和樣品狀態(tài)篩選合適的內(nèi)參基因。

目前，常用的內(nèi)參基因評價軟件包括ge?Norm、NormFinder和BestKeeper^[25]，本研究利用這3種評價軟件所分析的結(jié)果趨勢基本相同，略有差異，因為3種評價軟件對于內(nèi)參基因的選擇都是依據(jù)C_t值設(shè)計的，但計算原理和方法均有不同，結(jié)果也會有一定差異^[16]。geNorm軟件在對內(nèi)參基因的評價過程中不用考慮其他內(nèi)參基因結(jié)果來判定合適的內(nèi)參基因^{[9， 26]}，而NormFinder軟件需要考慮其他內(nèi)參基因再選擇合適的內(nèi)參基因^[10];BestKeeper軟件不但能分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，還能比較目的基因的表達水平^[11]。因此，在實際應(yīng)用過程中，需要充分考慮程序的適用性和特點，確保內(nèi)參基因篩選結(jié)果的準確性，降低實驗誤差。

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